蒺藜苜蓿DGAT1基因的克隆和功能鑒定

徐榮華，崔 濤，王建才，苗永美，錢立生， 胡慶森

(1 安徽科技學院 生命科學學院，安徽鳳陽 233100；2 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，濟南 250100)

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蒺藜苜蓿DGAT1基因的克隆和功能鑒定

徐榮華1，崔 濤1，王建才2，苗永美1，錢立生1， 胡慶森1

(1 安徽科技學院 生命科學學院，安徽鳳陽 233100；2 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，濟南 250100)

該研究采用RT-PCR與電子克隆的方法，從蒺藜苜蓿cDNA中克隆得到2個編碼二脂酰甘油酰基轉移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)的基因MtDGAT1-1和MtDGAT1-2。MtDGAT1-1長1 620 bp，編碼539個氨基酸；MtDGAT1-2長1 524 bp，編碼507個氨基酸。多序列比對顯示,MtDGAT1-1和MtDGAT1-2編碼蛋白具有典型的植物DGAT1結構域。表達分析顯示,MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在根、莖、葉、花、種子中都有表達，在種子發育中高表達,且MtDGAT1-1于種子發育的中前期高表達，而MtDGAT1-2于種子發育的中后期高表達。酵母互補實驗證實,MtDGAT1-2編碼蛋白具有DGAT酶活性，能夠恢復H1246的TAG合成和油體形成；而MtDGAT1-1編碼蛋白不能恢復H1246的TAG合成和油體形成。

二脂酰甘油酰基轉移酶；三脂酰甘油；蒺藜苜蓿；油體

三脂酰甘油(triacylglycerol，TAG)是真核生物中儲存能量和結構分子——脂肪酸(fatty acid, FA)的主要方式，也是油料作物種子油脂的主要成份，對于植物的生長、發育、繁衍具有重要的作用[1]，同時也是人類日常生活中的食物資源和化工原料[2]。TAG的生物合成分為兩步：FA的從頭合成及TAG組裝。FA的初始碳鏈合成和延長是在質體內進行的，以光合作用中間產物轉化的乙酰輔酶A(acetyl-CoA)為底物，在一系列脂肪酸合成酶復合體(fatty acid synthase complex，FAS)的共同作用下催化完成的。TAG組裝的胞內場所為內質網，以質體輸出的FA(脂酰ACP或脂酰輔酶A的形式)為底物，以三磷酸甘油(glycerol-3-phosphate，G3P)為骨架，在甘油-3-磷酸酰基轉移酶(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT)、溶血磷脂酸酰基轉移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT)、磷脂酸磷酸酶(phosphatidate phosphatase，PAP)和二脂酰甘油酰基轉移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)的次序催化下合成的。TAG組裝是Kennedy在1961年發現的，因此也被稱為Kennedy途徑[3]。

DGAT催化的反應是TAG合成的最后一步，因此被認為是TAG合成過程中的關鍵酶[4]。目前已發現的DGAT分為4類：DGAT1、DGAT2、可溶性的DGAT3和雙功能的DGAT4[5]。其中研究較多主要為DGAT1和DGAT2，這兩類DGAT在基因結構、編碼蛋白、進化和酶學活性及特異性等方面都存在巨大差異[5]，然而關于DGAT1和DGAT2對于種子油含量和油成分的作用如何，目前尚未完全明確。目前研究表明在不含特殊FA的植物中DGAT1對于種子油含量貢獻較大，而在含有特殊FA的植物中，DGAT2對于種子中特殊FA的積累具有較大的貢獻[6]。

蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)因倍性小(2n=16)，基因組小(5×108bp)，自花受粉及種子較多，再生時間較短，具有較高的遺傳轉化效率，有大量的突變體和多種生態型，具有較高的生物多樣性等特點，被認為是豆科模式植物[7-8]，從蒺藜苜蓿獲得的信息有助于其它豆科植物的研究。目前已從擬南芥、油菜、煙草、蓖麻、小桐子等多種植物中克隆和鑒定了DGAT1，然而對于蒺藜苜蓿DGAT1基因的功能卻未見報道。本課題以豆科模式植物蒺藜苜蓿A17為研究對象，通過克隆鑒定蒺藜苜蓿中編碼DGAT1的基因，不僅有助于揭示DGAT1基因在蒺藜苜蓿中對TAG合成的影響，同時可以進一步豐富植物DGAT1基因的理論研究，對于豆科植物基因發掘和種質創新具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大腸桿菌TOP10和蒺藜苜蓿A17由本實驗室保存。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)突變株H1246,由瑞典斯堪的納維亞生物技術研究中心的Sten Stymne教授贈送。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和反轉錄 將-80 ℃凍存的材料(A17的葉片)在液氮中研磨成粉，采用Trizol法[6]進行總RNA提取，RNA沉淀使用適量的DEPC水溶解，用1%甲醛變性瓊脂糖膠電泳法[6]對RNA進行質量檢測，用分光光度法[8]對RNA濃度進行估算。使用PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(大連寶生物)進行反轉錄獲得cDNA第一鏈。

1.2.2MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因克隆及序列分析 以AtDGAT1(NP_179535)為探針搜索蒺藜苜蓿基因組網站(http://www.jcvi.org/medicago/)的蛋白質數據庫，獲得Medtr2g039940和Medtr4g125980的參考序列，分別命名為MtDGAT1-1和MtDGAT1-2。基于參考序列設計ORF引物(表1)。以A17的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系按照Ex Taq(大連寶生物)說明配制。PCR反應條件為：94 ℃預變性 2 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，32個循環；72 ℃補充延伸 7 min。擴增產物電泳檢測后純化，克隆到pGM-T載體(北京天根生化有限公司)并轉化大腸桿菌TOP10，通過藍白斑篩選及菌液PCR鑒定陽性克隆后測序。引物合成由通用生物系統(安徽)有限公司完成，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 引物信息*

注: *劃線堿基為KpnI或XhoI位點

Note： * The underlined bases encode restriction enzyme site ofKpnI orXhoI

使用ORF finder對獲得的cDNA序列進行開放閱讀框分析；ProtParam在線分析蛋白的理化性質；TMHMM在線分析跨膜結構； MEGA 6.0進行進化樹構建[6]； Vector NTI 11軟件包的AlignX模塊構建多序列比對[6]。

1.2.3 表達模式分析和酵母表達載體構建及轉化 苜蓿基因MtDGAT1-1和MtDGAT1-2表達模式的數據來自蒺藜苜蓿基因組Nobel網站的表達芯片數據[8]，使用Excel進行數據分析，使用Origin進行作圖。

將所得MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因通過KpnI和XhoI(Fermentas)雙酶切克隆到酵母表達載體pWXY3.1上，分別構建酵母表達載體pWXY3.1- MtDGAT1-1和pWXY3.1-MtDGAT1-2。按照醋酸鋰-PEG法[6]轉化酵母菌株H1246,使用缺少尿嘧啶的合成培養基(synthetic minimal defined medium lacking uracil，SCU-)篩選陽性克隆，同時以空質粒pWXY3.1和含有釀酒酵母ScDGA1基因質粒pWXY3.1-ScDGA1做對照。在SCU-平板培養基上28 ℃生長2～4 d，挑取酵母菌斑進行PCR驗證。

1.2.4 轉基因酵母油脂分析和油體觀察 將轉基因酵母接種10 mL SCU-液體培養基(2%葡萄糖)，250 r/min、30 ℃培養過夜，測OD600，離心收集菌體，用SCU-液體培養基重懸菌體至OD600為 0.4，250 r/min、30 ℃重新開始培養。24 h后，進行尼羅紅染色觀測酵母油體。84 h后離心收集酵母細胞，使用酸熱法破碎細胞，使用正己烷∶異丙醇(3∶2)法提取酵母油脂進行TLC分析和油脂百分含量測定。轉基因酵母的油體觀察、油脂抽提、TLC層析按照參考文獻[3,6]記載的方法進行。

2 結果與分析

2.1 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的克隆和序列分析

以蒺藜苜蓿野生型A17的葉片為材料進行RNA抽提，反轉錄獲得cDNA，進行MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因克隆的PCR擴增，分別得到約1.5 kb目的條帶(圖1)，測序結果與預期序列完全一致。MtDGAT1-1開放閱讀框為1 620 bp，編碼蛋白長度為539個氨基酸，預測分子量為61.6 kD，理論等電點為8.27。MtDGAT1-2開放閱讀框為1 524 bp，編碼蛋白長度507個氨基酸，預測分子量為58.4 kD，理論等電點為9.00。MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在cDNA水平的序列相似性為70.5%，在蛋白質水平的序列相似性為73.5%。

M. Marker 2501； 1～2. MtDGAT1-1； 3～4. MtDGAT1-2圖1 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的克隆Fig.1 Amplification of MtDGAT1-1and MtDGAT1-2

BlastP結果顯示MtDGAT1-1和MtDGAT1-2均與其他植物DGAT1高度同源，與GmDGAT1(AAS78662)相似性分別為78.3%(MtDGAT1-1)和79.2%(MtDGAT1-2)，與LjDGAT1(AAW51456)的相似性分別為70.9%(MtDGAT1-1)和78.4%(MtDGAT1-2)，與RcDGAT1(AAR11479)的相似性分別為65.4%(MtDGAT1-1)和75.4%(MtDGAT1-2)。跨膜結構預測結果顯示MtDGAT1-1和MtDGAT1-2均含有9個跨膜結構域，推測MtDGAT1-1和MtDGAT1-2屬于膜蛋白。將MtDGAT1-1和MtDGAT1-2與AtDGAT1進行多序列比對分析，發現MtDGAT1-1和MtDGAT1-2具有典型的植物DGAT結構域，MtDGAT1-1、MtDGAT1-2和AtDGAT1的序列差異主要表現在N端，而C端區域和中間區域的氨基酸序列則相對保守(圖2)。比較MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的序列，可以發現MtDGAT1-1相對MtDGAT1-2在兩處出現較大的插入，一是MtDGAT1-2的Q74和N75之間插入KTDHAEGIVDDDDDNAVKK，二是S81和S82之間插入NDRENVA片段，推測這兩處插入可能與MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在蒺藜苜蓿中的功能分化相關。同時發現MtDGAT1-1和MtDGAT1-2均存在植物DGAT1中已知的結構域[6]：(1)脂酰輔酶A結合域(acyl-CoA binding motif)；(2)蔗糖非發酵相關蛋白激酶結構域(sucrose non-fermenting related protein kinase motif)；(3)硫酰酶中間體結合域(thiolase acyl-enzyme intermediate-binding motif)；(4)DGAT結構域；(5)脂肪酸結合域(fatty acid binding protein signature)；(6)二酰甘油或佛波酯結合域(DAG/phorbol ester binding motif)；(7)內質網定位信號(ER retrieval motif)。在MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的C端均發現的內質網定位信號遵循-Φ-X-X-K/R/D/E-Φ-COOH的規則[6]。系統進化分析(圖3)顯示，雙子葉植物的DGAT1聚為一支，單子葉植物DGAT1聚為一支，MtDGAT1-1和MtDGAT1-2與同屬豆科植物中大豆的GmDGAT1以及百脈根LjDGAT1聚在一起。

同源氨基酸殘基以黑色背景顯示，相似的氨基酸殘基以灰色顯示。脂酰輔酶A結合域、SnRK1蛋白激酶結構域、硫酰酶中間體結合域、DGAT功能域、脂肪酸結合蛋白簽名、DAG或佛波酯結合域和內質網定位信號分別使用藍色方框標出。關鍵的絲氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸分別以●、★、■、▲和◆標出。AtDGAT1. 擬南芥DGAT1圖2 MtDGAT1-1編碼蛋白、MtDGAT1-2編碼蛋白和AtDGAT1的多序列比對Identical residues are shaded black, and similar residues are shaded grey. Conserved motifs or putative signatures are blue boxed, such as the acyl-CoA binding motif, sucrose non-fermenting related protein kinase motif, thiolase acyl-enzyme intermediate-binding motif, DGAT motif, fatty acid binding protein signature, DAG/phorbol ester binding motif, and ER retrieval motif. Critical serine, proline, tyrosine, phenylalanine and histidine were marked by ●，★，■，▲and ◆, respectively. AtDGAT1. Arabidopsis thaliana DGAT1Fig.2 Multiple sequence alignment of deduced amino acid sequences of MtDGAT1-1, MtDGAT1-2 with AtDGAT1

括號內為氨基酸登錄號；分支上的數字為Bootstrap驗證中基于1 000 次重復該節點的可信度的百分比圖3 MtDGAT1-1和 MtDGAT1-2與其他植物DGAT1的進化樹分析The accession No. was given in bracket; The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstrap values based on 1 000 replicationsFig.3 Phylogenetic relationships of MtDGAT1-1, MtDGAT1-2 with other plant DGAT1s

圖4 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因的表達模式Fig.4 Expression pattern of MtDGAT1-1 and MtDGAT1-2

2.2 MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因的表達分析

以Nobel網站的基因芯片數據為基礎，構建了MtDGAT1-1和MtDGAT1-2基因的表達模式(圖4)，圖4顯示MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在蒺藜苜蓿的根、莖、葉、花和種子等組織中均有表達，MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在花、芽和莖中的表達差異不大。在根和葉中，MtDGAT1-2表達量高于MtDGAT1-1的表達量，MtDGAT1-2的表達量分別是MtDGAT1-1的2.3和1.8倍。在果中，MtDGAT1-2表達量低于MtDGAT1-1的表達量，MtDGAT1-2是MtDGAT1-1表達量的0.59倍。在種子中MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的表達存在明顯差異。MtDGAT1-1在苜蓿種子發育中呈現單峰表達模式，即在種子發育初期(10～12 d)表達量較低，隨著種子的發育表達量逐漸增高，在16 d時達到最高，隨后逐漸降低，36 d時降到最低，約為其第10天表達量的0.5倍。MtDGAT1-2在苜蓿種子發育中也呈現單峰的表達模式，也隨著種子的發育表達量逐漸增高，在24 d時達到最高，在36 d時仍維持著很高的表達量，約為其第10天表達量的7.5 倍。

2.3 釀酒酵母表達載體構建和互補實驗

為證實MtDGAT1-1和MtDGAT1-2編碼蛋白具有DGAT酶功能，使用酵母突變體H1246進行互補實驗，該突變體中負責中性油脂TAG和固醇酯合成的基因都被敲除，因此H1246既不能合成TAG，也不能形成油體[3]。通過KpnI和XhoI雙酶切和連接的方法將MtDGAT1-1和MtDGAT1-2插入酵母表達載體pWXY3.1，置于TEF1啟動子的下游和CYC1終止子的上游，菌落PCR的結果(圖5)證實酵母表達載體pWXY3.1-MtDGAT1-1和pWXY3.1-MtDGAT1-2已經構建成功。抽提質粒后使用醋酸鋰-PEG的方法將重組質粒導入H1246，同時以空質粒轉化為陰性對照，以轉化釀酒酵母ScDGA1為陽性對照挑取SCU-平板上陽性克隆進行擴大培養，提取油脂進行TLC層析和碘顯色，結果顯示轉化空質粒的陰性對照中TAG條帶處無斑點出現，轉化陽性對照ScDGA1的處理中可以檢測到TAG斑點，轉化MtDGAT1-1的處理中不能檢測到TAG斑點，轉化MtDGAT1-2的處理中可以檢測到TAG斑點(圖6，A)，這說明MtDGAT1-2的表達恢復H1246合成TAG的能力，而MtDGAT1-1不能恢復。隨后對轉基因酵母進行尼羅紅染色，結果表明MtDGAT1-1編碼蛋白不能互補H1246的油體缺陷表型，而MtDGAT1-2的表達則可以互補H1246的油體缺陷表型(圖6，B)。

圖5 pWXY3.1-MtDGAT1-1和pWXY3.1-MtDGAT1-2的菌落PCR結果Fig.5 Colonies PCR analysis of pWXY3.1-MtDGAT1-1 and pWXY3.1-MtDGAT1-2

ScDGA1編碼釀酒酵母內源的DGAT2圖6 轉基因酵母油脂的TLC層析(A)和油體觀察(B)ScDGA1 encoding endogenous DGAT2 of Saccharomyces cerevisiaeFig.6 TLC analysis (A) and oil body (B) of transgenic yeasts

3 討 論

研究表明在牲畜快速生長時添加高油飼料(如高油玉米)能顯著改善牲畜的生產性能以及畜產品的品質[9]。紫花苜蓿被譽為牧草之王，在世界各國廣泛種植，然而其葉片幾乎不含油脂，嚴重限制了紫花苜蓿作為高油飼料的應用。植物通常不在葉片中積累TAG，但是近年來的研究表明在煙草葉片中異位表達擬南芥AtDGAT1、AtWRI1和AtOLE1可以使得葉片積累干重30%的油脂[10]。研究也表明模式植物擬南芥的研究結果在紫花苜蓿中并不適用，如在苜蓿中異位表達調控花青素代謝途徑的轉錄因子AtPAP1不能導致苜蓿葉片中花青素的積累，而異位表達苜蓿中AtPAP1的同系物MtLAP1則可以導致苜蓿葉片中大量積累花青素[8]，暗示擬南芥和苜蓿中的代謝調控機制的細節并不相同。理解苜蓿TAG合成和積累的分子機制是使用基因工程技術發展高油牧草的前提。然而紫花苜蓿是四倍體，基因組復雜，難以操作[7-8]。而蒺藜苜蓿是二倍體，且與紫花苜蓿的親緣關系較近，基于蒺藜苜蓿的研究可以直接推廣到紫花苜蓿上面。

本研究從蒺藜苜蓿中克隆得到2個編碼DGAT1的基因MtDGAT1-1和MtDGAT1-2，并對其功能進行了初步的分析和鑒定。前人研究表明硫解酰基酶結合域中存在一個重要的脯氨酸殘基，在玉米中此脯氨酸殘基的缺失可使得DGAT酶活下降50%，異位表達帶有此脯氨酸殘基的玉米DGAT1可使得玉米種子中油含量增加41%，油酸含量增加107%[11]，MtDGAT1-1在此位置氨基酸殘基為絲氨酸，而MtDGAT1-2在此位置則為脯氨酸，暗示MtDGAT1-2具有DGAT酶活性，而MtDGAT1-1可能沒有DGAT酶活性。使用酵母突變株H1246對MtDGAT1-1和MtDGAT1-2進行功能互補驗證，TLC分析和尼羅紅染色的結果都顯示異源表達MtDGAT1-2可以恢復H1246的TAG合成和油體形成，暗示MtDGAT1-2具有DGAT酶活，而MtDGAT1-1不能恢復H1246的TAG合成和油體形成，暗示MtDGAT1-1可能不具有DGAT酶活。AtDGAT2曾一度被認為是編碼無功能的DGAT酶，因為AtDGAT2不能互補H1246，而且擬南芥中AtDGAT2的突變沒有產生影響種子油含量和成分改變的表型，然而后續的研究表明對AtDGAT2進行酵母密碼子優化表達則可以使得AtDGAT2互補H1246[12]，在煙草葉片中瞬時表達的結果也證實AtDGAT2能夠催化合成TAG，但具有脂酰基輔酶A底物的依賴性[13]，因此推斷AtDGAT2不易互補H1246的原因在于植物和酵母密碼子偏愛的差異以及酵母中沒有合適的底物。據此同樣可以推斷MtDGAT1-1不能互補H1246也可能是因為密碼偏愛性和酵母中不存在MtDGAT1-1偏愛的脂酰基輔酶A底物，因此是否MtDGAT1-1為無功能的DGAT，仍需進一步的實驗證實。

先前的研究發現在多數二倍體物種DGAT1通常為單一拷貝，如擬南芥、蓖麻、小桐子等植物[6]，目前僅在斑鳩菊中發現2個DGAT1，分別為VgDGAT1a和VgDGAT1b，二者在核苷酸水平的相似性為92%，蛋白質水平的相似性為94%[14]，遠高于本研究克隆的MtDGAT1-1和M12在核苷酸和蛋白質水平的相似性，暗示VgDGAT1a和VgDGAT1b是屬于斑鳩菊內部的基因進化事件的結果。進化樹研究中，MtDGAT1-2與GmDGAT1和LjDGAT1聚在一起，而MtDGAT1-1單獨一枝，說明MtDGAT1-1與MtDGAT1-2形成的分歧要早于豆科物種內部分化開始之前，這也表明MtDGAT1-1與MtDGAT1-2不是簡單的基因復制關系。為何在蒺藜苜蓿中出現2個序列差異如此之大的DGAT1基因，需要進一步研究。

對旱金蓮和小桐子中的DGAT1基因時空表達研究發現DGAT1在根、莖、葉、花、種子中都可以檢測到表達，在種子中的表達量顯著高于其他組織，而且表達豐度的變化與種子中油脂積累的曲線變化正相關[6,11]。本研究中MtDGAT1-1和MtDGAT1-2表達與旱金蓮和小桐子中DGAT1的研究相一致，說明MtDGAT1-1和MtDGAT1-2與苜蓿中油脂的積累相關。在發育的初期，MtDGAT1-1的表達明顯高于MtDGAT1-2的表達，MtDGAT1-1的表達高峰(16 d)也比MtDGAT1-2(24 d)出現早，在種子接近成熟的36 d，MtDGAT1-1的表達已經降到與葉片中水平類似的時候，MtDGAT1-2的表達水平仍然很高，推測MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在苜蓿種子發育中都起作用，MtDGAT1-1發揮作用的時段主要為中前期，可能與種子的胚發育和成熟有關，而MtDGAT1-2發揮作用則主要為中后期，可能與子葉中油脂的積累相關。

綜上所述，本研究首次從蒺藜苜蓿cDNA中克隆得到2個編碼DGAT1的基因MtDGAT1-1和MtDGAT1-1，發現MtDGAT1-1和MtDGAT1-2在根、莖、葉、花、種子中都有表達，在種子發育中期表達量最高，同時也發現MtDGAT1-1高表達種子發育的中前期，而MtDGAT1-2則高表達于種子發育的中后期。酵母互補實驗證實MtDGAT1-2編碼蛋白具有DGAT酶活性，能夠恢復H1246的TAG合成和油體形成；而MtDGAT1-1編碼蛋白不能夠恢復H1246的TAG合成和油體形成。考慮到酵母互補系統沒有能夠成功檢測到MtDGAT1-1編碼蛋白的活性，本實驗室下一步擬采用煙草瞬時表達系統來測試MtDGAT1-1和MtDGAT1-2的功能，從而探討MtDGAT1-1和MtDGAT1-2對于TAG合成和FA成份的限制作用。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Functional Characterization of Diacylglycerol Acyltransferase Gene (MtDGAT1) from Medicago truncatula

XU Ronghua1, CUI Tao1, WANG Jiancai2, MIAO Yongmei1, QIAN Lisheng1, HU Qingsen1

(1 College of Life Sciences, Anhui Science and Technology University, Fengyang, Anhui 233100, China; 2 Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

In this study, we acquired twoMtDGAT1 genes (MtDGAT1-1 andMtDGAT1-2) from cDNA ofMedicagotruncatulaby using insilico cloning combined with RT-PCR. The length ofMtDGAT1-1 is 1 620 bp, encoding 539 amino acids, while the length ofMtDGAT1-2 is 1 524 bp, encoding 507 amino acids. Multiple alignments revealed that both MtDGAT1-1 and MtDGAT1-2 shared the typical functional motifs with DGAT1s from other plant species. Expression analysis showed that bothMtDGAT1-1 andMtDGAT1-2 were expressed in root, stem, leaf, flower and seed, and highly expressed in developing seeds;MtDGAT1-1 was highly expressed in early-middle periods of seed development, whileMtDGAT1-2 was highly expressed in the middle and later periods of seed development. Functional complementation in yeast H1246 confirmed thatMtDGAT1-1 encodes disfunctional DGAT andMtDGAT1-2 encodes functional DGAT.

diacylglycerol acyltransferase; triacylglycerol;Medicagotruncatula; oil body

1000-4025(2016)10-1941-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1941

2016-06-14;修改稿收到日期:2016-08-26

國家自然科學基金青年基金(31300569)；安徽省教育廳2016振興計劃(gxfxzD2016181)

徐榮華(1979-)，男， 博士，講師，主要從事生物技術和生物工程研究。E-mail：xrh96@163.com

Q785；Q786; Q789

A