發狀念珠藻干旱脅迫響應基因NfGR的克隆與鑒定

岳思君，范紅麗，鄭 蕊，周 娟，蘇建宇

(寧夏大學 生命科學學院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室, 銀川 750021)

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發狀念珠藻干旱脅迫響應基因NfGR的克隆與鑒定

岳思君，范紅麗，鄭 蕊，周 娟，蘇建宇*

(寧夏大學 生命科學學院，西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室, 銀川 750021)

該研究采用PCR技術，從發狀念珠藻細胞中克隆了谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)基因，命名為NfGR，其開放閱讀框長1 374 bp，編碼458個氨基酸，蛋白相對分子量為49.42 kD，理論等電點為5.49。氨基酸序列分析表明，NfGR蛋白具有NADPH結合位點超家族(NADB-Rossmann superfamily )和吡啶氧化還原酶二聚體超家族(Pyr_redox_dim superfamily) 2個結構域，與點形念珠藻(Nostocpunctiforme)的相似性達93%。系統進化樹分析表明，NfGR與點形念珠藻處在同一進化枝上，親緣關系較近。qRT-PCR表達分析表明，在不同濃度PEG-6000處理下，NfGR基因均保持上調表達，其中，PEG-6000濃度為8%時，NfGR基因的相對表達量達到峰值(32.69)。研究推測，谷胱甘肽還原酶可能參與了發狀念珠藻對干旱脅迫過程的響應。

發狀念珠藻，谷胱甘肽還原酶，基因克隆，熒光定量PCR

發狀念珠藻(Nostocflagelliforme),又稱發菜，是生長在中國西北干旱和半干旱荒漠地區的陸生藍藻，是一種旱生藍藻類(blue-green algae)低等植物，有很強的耐干旱、耐低溫和耐輻射能力[1-2]。其固氮能力很強，是干旱荒漠區主要生物固氮資源。同時，發狀念珠藻還具有極高的食用價值和經濟價值，其藻體內含有豐富的膠質和多種營養物質，對改良荒漠化土壤結構及理化性質有一定作用，可為其他有益土壤微生物提供可利用的碳源和氮源。因此，發狀念珠藻在干旱荒漠區具有十分重要的生態學意義。目前研究最多的是發狀念珠藻的生理生化、分布、生態、顯微結構、生長發育、營養成分和人工栽培等方面[3-7]，對發菜的生物學特性有了一定的認識，但分子方面的研究尚屬起步階段，從分子水平研究其耐逆及適應機制、尋找其生長發育規律以及實現發狀念珠藻人工培養，多年來一直是研究者關注的熱點[8-9]。

還原型谷胱甘肽(GSH)作為一種水溶性、小分子量的抗氧化劑，它是細胞中主要的非蛋白巰基庫，是細胞中維持正常氧化還原狀態的重要組成部分，參與許多重要的生理生化過程。植物細胞的葉綠體、細胞質、線粒體等細胞區域都含有較高濃度的谷胱甘肽[10]。植物體內細胞的多種生理生化反應都可產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)。正常生長條件下，植物細胞中 ROS 維持在較低的水平，然而，極端溫度、高鹽、強光照、重金屬、紫外光輻射、O3和SO2、機械損傷等環境脅迫可引起ROS的大量增加，若不及時清除，會對植物細胞產生嚴重傷害。植物體內存在清除ROS的抗氧化系統，其中谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)是谷胱甘肽抗氧化系統的主要酶之一。它在NADPH存在的情況下，催化氧化型谷胱甘肽(GSSG) 還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，以對抗氧化脅迫。防止GSSG和其它二硫化合物的積累，對細胞膜、核酸、脂類、血紅蛋白和酶的穩定是必需的[11-12]。因此GR對GSH的再生以保持正常的 GSH/GSSG 比例，維持植物細胞的氧化還原平衡有重要意義，在植物抗氧化系統乃至整個生長發育過程中發揮重要作用[13]。此外，GR對抗壞血酸的循環再生也是不可缺少的，GR通過參與植物抗壞血酸谷胱甘肽循環(AsA-GSH cycle)，并與超氧化物歧化酶(SOD)等酶系統相互作用，共同清除植物體內多余的 ROS，能夠增強植物對干旱、鹽、低溫和病害等脅迫的抵御能力。大量研究已經表明，在植物的細胞質、葉綠體、線粒體以及溶酶體中均有GR的活性[14-17]，而且GR活性會在非生物逆境環境下提高。岳川等[18]成功克隆了茶樹的谷胱甘肽還原酶的基因，推測其在茶樹抵抗逆境脅迫中起作用。朱守晶等[19]克隆了苧麻谷胱甘肽還原酶基因BnGR1，根據組織表達分析結果，推測其在減輕鎘脅迫對苧麻的毒害方面發揮作用。

研究發現，發狀念珠藻中存在一個穩定的保護系統，在抵抗極端的脅迫環境中協助SOD和過氧化氫酶(CAT)共同發揮重要作用，有關 GR 基因的研究少見報道。本研究克隆發狀念珠藻NfGR基因的ORF序列，并對其編碼氨基酸的結構進行生物信息學預測。同時，分析了PEG-6000脅迫下基因的逆境表達特性。以期為進一步研究該基因在發狀念珠藻抗逆中的功能提供科學依據，對構建抗旱轉基因工程菌的研究提供候選基因，有效地保護荒漠微生物基因資源。

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗材料為液體懸浮培養發狀念珠藻細胞，保存于寧夏大學生命科學學院應用微生物學實驗室，培養條件為25 ℃、80 r/min光照培養，生長培養基為BG11培養基。8 000 r/min離心收集藻細胞，保存于-80 ℃冰箱備用。

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5a感受態細胞、DNA Marker、TaqDNA 聚合酶、Protein MarkerⅢ、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根公司。pGEM?-T Easy 載體、T4 DNA 連接酶購自美國Promaga 公司。限制性內切酶BamH I、HindⅢ購自美國Fermentas公司。引物合成及基因測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方 法

1.2.1NfGR基因開放閱讀框的擴增 取50 mg發狀念珠藻藻細胞，-80 ℃速凍，液氮研磨成粉末，采用CTAB法提取發狀念珠藻基因組DNA，電泳檢測DNA質量。

根據發狀念珠藻基因組精細測序圖中GR基因的ORF序列設計引物GR-F(5′-CGCGGATCCATGACTTTTGATTACGACCT-3′，劃線部分為BamHⅠ酶切位點)和GR-R(5′-CCCAAGCTTTTACCGCATTGTGACAAATT-3′，劃線部分為HindⅢ酶切位點)。以發狀念珠藻總DNA 為模板，進行PCR 擴增。擴增條件為：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min。目的片段經回收、檢測并測序。

1.2.2NfGR基因的生物信息學分析 運用生物信息學數據庫 NCBI、ExPASy、MEGA5.1 等軟件對發狀念珠藻NfGR基因編碼蛋白進行生物信息學分析。

1.2.3NfGR基因qRT-PCR分析 以發狀念珠藻RPL13基因為內參，進行qRT-PCR檢測，分析NfGR基因的表達特性。NfGR基因上下游引物分別為GR-qF(5′-CCTTGAGCGTGAGTGG-3′)和GR-qR(5′-TCGGCATTGATGACGATTAC-3′)。RPL13基因上下游引物分別為RPL13-F(5′-TAGAGTTTGCCTGTATCAT-3′)和RPL13-R(5′-TCCGTGGTTTGTCATC-3′)。qRT-PCR擴增程序為：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，共45個循環。實驗共設3個重復，利用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 NfGR基因的開放閱讀框(ORF)克隆

以發狀念珠藻基因組DNA為模板，GR-F 和GR-R 為引物進行PCR擴增，獲得1條1 350 bp左右的特異條帶(圖1)。將回收片段連接至pMD18-T載體, 轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞后進行菌落PCR鑒定。

BamHI/HindⅢ雙酶切質粒，得到2條帶，其中1條為1 350 bp左右的目的條帶(圖2)，與預期的擴增片段大小一致 。將陽性克隆送至上海生工生物技術有限公司測序，由測序結果可知，NfGR基因的ORF長1 374 bp。

2.2 NfGR基因編碼蛋白的結構分析

氨基酸序列分析發現，NfGR基因ORF可編碼458個氨基酸殘基，預測分子量為49.42 kD。NfGR蛋白有2個結構域(圖3)，分別是NADPH結合位點超家族(NADB-Rossmann superfamily)和吡啶氧化還原酶二聚體超家族(Pyr_redox_dim)，其中165～245氨基酸序列是吡啶二硫酸氧化還原酶的組分，345～458氨基酸序列是吡啶二硫酸核酸氧化還原酶二聚體結構域，這些功能保守區的存在與谷胱甘肽還原酶的還原作用密切相關。

M. DL2000；N.陰性對照；1～2. PCR產物圖1 NfGR基因編碼序列的克隆M. DL2000；N. Negative control；1～2. PCR productFig.1 Cloning of the coding sequence of NfGR

M. Marker；1.HindⅢ 單酶切；2.未酶切質粒；3～4.BamH I/ HindⅢ雙酶切圖2 NfGR基因陽性克隆質粒酶切結果M. Marker；1. HindⅢ digested plasmid；2. Non-digested plasmid；3～4. BamHⅠ/ Hind Ⅲdigested plasmidFig.2 Enzyme digestion of NfGR gene cloned plasmid

圖3 NfGR蛋白保守結構域Fig.3 Prediction of the conserved domains of NfGR

黑色表示序列完全相同，灰色表示部分相同，下劃線區為谷胱甘肽還原酶結構域序列；NpGR、NspGR、HbGR、AvGR、ShGR、TcGR、StGR、DcGR、TbGR、AfGR、HspGR和NfGR分別為點形念珠藻、念珠藻、綿絲哈沙藻、多變魚腥藻、霍夫曼偽枝藻、彎曲單歧藻、單歧偽枝藻、彎曲長孢藻、鮑氏單歧藻、水華束絲藻、軟管藻和發狀念珠藻GR氨基酸序列圖4 谷胱甘肽還原酶氨基酸序列的多重比對Black area donates the same sequence，gray area donates partial matching，the underline marks domain sequences in GR proteins; NpGR, NspGR, HbGR, AvGR, ShGR, TcGR, StGR, DcGR, TbGR, AfGR, HspGR and NfGR represents amino acid sequence of GR from Nostoc punctiforme PCC 73102, Nostoc sp. PCC 7120, Hassallia byssoidea VB512170, Anabaena variabilis ATCC 29413, Scytonema hofmanni UTEXB 1581, Tolypothrix campylonemoides VB511288, Scytonema tolypothrichoides VB-61278, Dolichospermum circinale, Tolypothrix bouteillei VB521301, Aphanizomenonflos-aquae, Hapalosiphon sp. MRB220 and Nostoc flagelliforme，respectivelyFig.4 Multiple alignment of the deduced amino acids sequences of GR proteins

以NfGR基因編碼氨基酸序列為信息探針，用Blast程序檢索GeneBank的NR數據庫發現，NfGR蛋白的氨基酸序列與已報道的其他物種GR蛋白氨基酸序列具有較高的相似性。與點形念珠藻(Nostocpunctiforme)的相似性最高，達到93%，與多變魚腥藻(Anabaenavariabilis)的相似性為86%，與綿絲哈沙藻(Hassalliabyssoidea)、霍夫曼偽枝藻(Scytonemahofmanni)、彎曲單岐藻(Tolypothrixcampylonemoides)相似性為85%，與水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)和軟管藻(Hapalosipnonsp.)相似性為80%，與卷曲長孢藻(Dolichospermumcircinale)相似性為79%。用ClustalX2.1軟件進行多序列比對發現NfGR編碼氨基酸序列與其他物種有差異，但具有催化氧化還原反應和結合GSSG、NAD的高度保守的區域(圖4)。

GOR4在線軟件預測發現，α-螺旋、β-片層和無規卷曲是 NfGR蛋白二級結構的主要結構元件(圖 5，A)。進一步通過SWISS-MODEL 在線工具(http://swissmodel.expasy.org/)進行建模分析，結果顯示這些α-螺旋、β-片層和無規卷曲通過延伸鏈連接折疊成對稱的三維空間結構(圖 5，B)。

2.3 NfGR基因的系統進化分析

采用MEGA 5.1軟件構建發狀念珠藻GR蛋白系統進化樹(圖6)。結果顯示，發狀念珠藻與點形念珠藻(Nostocpunctiforme)聚為一支，在進化上親緣關系最近。彎曲單岐藻(Tolypothrixcampylonemoides)、軟管藻(Hapalosiphonsp.)、鮑氏單歧藻(Tolypothrixbouteillei)、單歧偽枝藻(Scytonematolypothrichoides)、綿絲哈沙藻(Hassalliabyssoidea)和霍夫曼偽枝藻(Scytonemahofmanni)為另一支，卷曲長孢藻(Dolichospermumcircinale)和水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)則聚為一支；念珠藻(Nostocsp.) 和多變魚腥藻(Anabaenavariabilis)聚為另外一支。

A. 二級結構預測； B. 利用SWISS-MODEL建立的三維結構圖5 NfGR蛋白的結構分析和建模A. Secondary structure prediction;B. Three-dimensional structure based on SWISS-MODELFig.5 Structure analysis and modeling of NfGR

系統樹各分支上數字是Bootstrap 1 000次循環檢驗的置信度；標尺代表遺傳距離圖6 NfGR蛋白進化樹分析The numbers on the tree branches represent Bootstrap confidence values as bootstrap is 1 000；The scale bar represents genetic distanceFig.6 Phylogenetic analysis of NfGR protein sequences

圖7 PEG-6000脅迫下NfGR基因的表達分析Fig.7 Expression analysis of NfGR gene under drought-stress of PEG-6000

2.4 干旱脅迫下NfGR基因表達分析

用實時熒光定量RT-PCR技術，分析不同濃度PEG-6000模擬干旱處理下NfGR表達情況(圖7)。結果表明，相對于對照，NfGR基因在不同濃度PEG-6000處理下均保持上調表達。PEG-6000 濃度為2%時，NfGR基因受到誘導，表達量開始上升，當PEG-6000 濃度為8%時，相對表達量為32.69，達到峰值。當PEG-6000濃度為10%時，NfGR表達量下降，說明在高濃度PEG-6000脅迫下，細胞受到損傷嚴重，NfGR基因的表達受到抑制。

3 討 論

植物耐旱能力的形成是由多個基因協同參與形成的，耐逆性調節基因的上調表達在一定程度上提高了植物的耐逆能力。生物在生長過程中經常會遭受到干旱脅迫，過度干旱脅迫會導致生物體內ROS的代謝失衡，進而對機體造成氧化損傷，如可引起蛋白質、膜脂和其它細胞組分的損傷，進而導致細胞及組織死亡。但在長期的進化過程中，生物本身會產生一些保護機制來清除過多的ROS，一些抗氧化酶系統，包括GR、APX、CAT、SOD和PRX等在內的完整的抗氧化防御體系，積極參與這一過程。

GR是植物細胞抗氧化酶系統中的一個重要蛋白，催化氧化型谷胱甘肽還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，維持細胞內氧化還原狀態的平衡，在植物抵抗非生物脅迫的環境中起到重要作用。GSH在減緩和清除由ROS、生物異源物質及重金屬造成的環境氧化脅迫中起重要作用，GSH可有效還原-S-S-鍵，穩定-SH族蛋白，使膜蛋白結構穩定，保護酶結構蛋白上的-SH，抵抗過氧化作用，充當自由基的清除劑。植物GR同工酶存在于不同的亞細胞器中，如葉綠體、細胞質、線粒體和過氧化物酶體等[20-24]。GR是受逆境脅迫表達的酶之一，在水分脅迫下，細胞器的抗氧化酶活性均表現為先升高后穩定到一定水平，這表明植物細胞中各細胞器能夠協調抗氧化防護的能力。在氧化脅迫反應中，GR通過活性的升高對清除活性氧起積極作用。Tanaka 等[25]證明干旱等逆境脅迫會引起菠菜 GR活性的提高。

發狀念珠藻是具有較強的耐旱能力的藍藻類低等植物，在水分脅迫下會引起一系列干旱誘導基因的表達，例如編碼一些功能蛋白和調節蛋白的基因，以保護細胞不受水分脅迫的傷害，來抵御環境脅迫。因此，選擇抗旱優良基因，對基因功能進行研究，從分子水平認識發狀念珠藻對干旱環境脅迫的抗性機理顯得尤為重要。

發狀念珠藻NfGR基因的表達因受干旱脅迫發生了變化，即在脅迫初期活性氧濃度增加，抗氧化酶系統積極參與，NfGR 表達量開始增加；隨脅迫濃度增加，表達量達到峰值；但隨脅迫濃度繼續增加，細胞相關組分受到干旱傷害，以致NfGR基因表達量在高濃度PEG-6000模擬干旱脅迫時降低，這可能因為高濃度PEG-6000模擬干旱增加了細胞生長環境的干旱程度，細胞內成分因嚴重缺水而損傷，基因的表達呈下降趨勢。發狀念珠藻NfGR基因的表達量增加是對干旱脅迫的積極響應，表明其在抵御外界干旱環境過程中發揮一定作用。有關受逆境脅迫時，NfGR 清除活性氧、參與跨膜運輸和信號傳導的具體分子機理還需要深入的研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Identification of Drought-stress Responsive Gene NfGR in Nostoc flagelliforme

YUE Sijun, FAN Hongli, ZHENG Rui, ZHOU Juan, SU Jianyu*

(College of Life Sciences, Ningxia University, Key Lab of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China, Yinchuan 750021, China)

Glutathione reductase is one of enzymes participating in the oxidation reduction reaction in organisms, which plays an important role in the process of stress tolerance. As a kind of cyanobacteria,Nostocflagelliformepossesses strongly resistance to environment stresses，so it is meaningful to study the role of glutathione reductase in the resistant mechanism. In order to explore the biological functions of glutathione reductase in process of stress tolerance inN.flagelliforme, we cloned the complete open reading frame of the geneNfGR, and took a bioinformatics analysis of gene sequence. The ORF ofNfGRcontains 1 374 bp, encoding 458 amino acids, and its relative molecular weight and theoretical isoelectric point is 49.42 kD and 5.49, respectively. Amino acid sequence analysis showed that the protein NfGR has two domains of NADB-Rossmann superfamily and Pyr redox dim superfamily, and amino acid sequence of NfGR protein is similar to that ofNostocpunctiformewith similarity up to 93%. Phylogenetic tree reconstructed by neighbor joining method clearly showed that NfGR protein was classified into a subgroup withN.punctiforme, which suggested their close relationship. qRT-PCR result showed that the expressions ofNfGRgene were up-regulated under different concentrations of PEG-6000, and reached peak at 8% PEG-6000 concentration, with the relative expression level of 32.69. It is hypothesized that glutathione reductase may be involved in the response to stress resistance ofN.flagelliformeaccording to its expression characteristics.

Nostocflagelliforme; glutathione reductase; gene cloning; quantitative real-time PCR

1000-4025(2016)10-1955-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.1955

2016-06-18;修改稿收到日期:2016-09-07

國家自然科學基金(31360025，31260023，31560418)；寧夏大學研究生創新項目(GIP201611)

岳思君(1972-)，男，博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事微生物學研究。E-mail: sijunyue@126.com

*通信作者:蘇建宇，博士，教授，碩士研究生導師，主要從事微生物學研究。E-mail: su_jy@nxu.edu.cn

Q785; Q786

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