Ca2+信號在植物與環境微生物互相作用中的分子調控機制

鞏雪峰，宋占鋒*，苗明軍，李躍建

(1 四川省農業科學院園藝研究所，成都 610066；2四川省農業科學院，成都 610066)

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Ca2+信號在植物與環境微生物互相作用中的分子調控機制

鞏雪峰1，宋占鋒1*，苗明軍1，李躍建2

(1 四川省農業科學院園藝研究所，成都 610066；2四川省農業科學院，成都 610066)

自然界植物與環境微生物之間的相互關系除了脅迫以外，同時也有互利互惠的共生互作關系。無論是能對植物造成脅迫傷害的植物-病原菌互作體系，還是能夠為植物提供營養的植物-微生物共生互作體系，其細胞信號轉導通路中Ca2+信號的分子調控對兩種互作體系都有著非常重要的作用。該文對近年來國內外有關植物-病原菌和植物-微生物互作體系在細胞信號轉導過程中Ca2+信號上游的分子調控機制分別進行了綜述。

Ca2+信號；內共生；病原菌；細胞信號轉導

自然界中，植物與動物的本質區別之一是沒有自然行走的能力，它們一旦固定了生長環境，一生都不可更換。那么，當植物在遭受環境帶來的不適時，它們就不能用移動或者遷移的方式躲避傷害。通常植物既要面對由環境氣候改變而帶來的各種逆境刺激，如干旱、寒冷、高溫、高濕等非生物脅迫；也要面對其所在自然生物群落中各種外源微生物的侵染，如由病原菌導致的生物脅迫。植物為了生存，只能通過將外界脅迫信息整合到內在細胞中，再通過完整、精確的細胞信號轉導體系實現對自身機制的調節。在這個過程中，外源脅迫刺激被細胞膜識別進入細胞質，并以特異的信號形式傳遞給細胞核，隨后轉化成能適應這個刺激的特異基因表達，產生相應的應答反應，最終調控植物生理和生長[1]。

在一個自然生物群落中，植物受到環境微生物的入侵后，彼此隨即建立相互作用的關系。這種關系除了脅迫以外，同時也存在互利互惠的共生關系。植物與微生物的互作關系就微妙得猶如硬幣的正反面，雖然一面有害，但是另一面又有利。其正反雙方內在細胞信號轉導體系信號調控分子具有相似性，該相似性反應為Ca2+對胞內信號通路所具有的調控作用。研究表明，微生物如根瘤菌或者叢枝菌根菌等是通過互惠的內共生信號系統入侵到植物的根系細胞，形成根瘤或根系生節的過程。在該信號通路中，植物與微生物雙方成功發生互作的標志即是鈣離子振蕩(Ca2+oscillation)的形成[2-4]。與此同時，病原菌微生物與植物的互作是植物通過先天免疫系統抵御外源刺激的過程。在該信號通路中，細胞質第二信使Ca2+通過參與瞬間改變細胞質鈣離子濃度([Ca2+]cyt)的形式將刺激信號傳遞至下游[5-10]。

在上述兩個植物細胞信號通路系統中，Ca2+將細胞外的刺激以信號的形式整合到細胞內，同時將刺激信號特異地放大并傳遞到下游，細胞核內轉錄因子對信號進行轉錄，誘導相應基因表達和細胞應答。只有Ca2+信號上游的細胞膜受體對外界刺激實現跨膜轉換，激活細胞膜系統上鈣離子通道的開放，引起細胞內Ca2+濃度在時間、空間、頻率、幅度等不同形式的特異性變化后，才能導致下游特異的基因表達及生理應答。因此，在環境微生物與植物互作的分子機制中，Ca2+信號的調控是植物感受外界刺激后引起細胞信號應答及生理反應的主要調控因子之一，對整個信號轉導體系發揮著非常重要的作用。

近年來，科學家在植物基因組學領域對植物基因功能的探索已經取得了大量的研究成果。從而使得我們對植物共生互作和生物脅迫互作體系有了更深層次的了解。本文就植物細胞Ca2+上游信號分子在微生物與植物的共生互作和脅迫互作中的調控進行概述。

1 植物與微生物互作的正面關系——植物內共生體系

自然界多數植物能夠與微生物建立互利互惠的共生關系，形成植物根系內共生體系(symbiosis pathway)。在內共生體系中，目前研究最廣泛的兩個類型分別是真菌類的叢枝菌根菌(arbuscular mycorrhizal fungi)-植物互作[11]，以及細菌類固氮根瘤菌(rhizobial bacteria)-豆科植物的互作[12]。通常在根瘤菌(rhizobium)-豆科植物互作的根細胞內共生體系中，根瘤菌將環境中的氮氣還原為植物可利用的含氮化合物，同時根瘤菌則從植物根系獲得其生長繁殖所需的能量和營養物質，最終促成植物根系結瘤[13-14]。在叢枝菌根菌-植物互作的根細胞內共生體系中，菌根菌所形成叢枝菌絲(arbuscule)能夠擴大根系與土壤的接觸面積，增加根系對土壤中水分和礦質營養元素(尤其是P)的吸收。叢枝菌根再通過植物根系獲得生長和生節所需的碳水化合物以及其他營養物質[15]。

在共生互作體系中，細菌和真菌分別對宿主植物進行侵染，宿主植物的根細胞固定根瘤菌或叢枝菌根菌后并分別釋放化學信號類黃酮(flavonoids)或獨腳金內酯(strigolactones)，誘導宿主根細胞自身產生信號分子結瘤因子(nod factors)或菌根因子[Myc(orrhizal) factors]，并進入宿主植物細胞，開啟共生信號通路(symbiotic signalling)，激活細胞共生信號應答反應體系(圖1，A)[16]。信號分子結瘤因子和菌根因子在結構上都屬于脂質幾丁寡糖類物質(lipochitooligosaccharides，即LCOs)[16-17]。

在根瘤菌-豆科植物互作體系中，結瘤因子通過識別細胞膜上含有LysM受體激酶結構域(lysine motif)的受體蛋白進入細胞質，目前，已被定義的受體蛋白如百脈根(Lotusjaponicus)細胞膜上的受體蛋白NFR1 (nod-factor receptor 1) 和NFR5 (nod-factor receptor 5)；豆類植物細胞膜上的受體蛋白 SYM2(symbiosis receptor 2)[18-20]。共生信號通路中同時也有另一類受體如百脈根細胞膜上SYMRK蛋白(symbiosis receptor-like kinase)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的DMI2受體蛋白，也稱NORK(does not make infection 2/nordulation receptor kinase)。這兩個受體都含亮氨酸重復序列LRR(leucine-rich-repeat)，但目前該類受體的功能尚未得到完整定義，研究報道指出在共生信號體系中SYMRK或DMI2是作為受體復合體轉導結瘤信號[19-20]。叢枝菌根菌-植物互作體系與根瘤菌-豆科植物互作基本相似，菌根菌與蒺藜苜蓿根細胞共生體系信號的應答反應，菌根菌同樣依賴所產生的菌根因子LCOs類物質來啟動與宿主植物根系的生節生長反應，通過識別根細胞膜上LysM受體蛋白激酶(lysine-like kinase)類物質[17]。

A. 植物—根瘤菌/叢枝菌根互作信號通路;B. 植物—病原菌互作信號通路圖1 植物與環境微生物互作信號通路A. The signaling pathway on plant-Rhizobium / Arbuscule interaction; B. The signaling pathway on plant-pathogen interactionsFig.1 The signaling pathway on plant and environmental microorganism interactions

根瘤因子和菌根因子通過細胞膜受體蛋白進入細胞的內共生信號級聯通路，隨后信號分子鈣在細胞核和核膜區域發生鈣離子振蕩[12,16]。研究指出，蒺藜苜蓿DMI1(doesn’t make infections 1)在根瘤菌結瘤的過程中與產生鈣信號有關。DMI1就是產生鈣離子振蕩的通道蛋白[21]。該蛋白由于其基因缺陷突變體苗不能結瘤而得名[22]。通過熒光GFP融合蛋白和免疫金標記技術表明，DMI1被定義在表皮細胞核膜的內核上[23-24]。目前DMI1對鈣離子信號如何進行調控還沒有完全被揭示，Capoen、Charpentier等認為DMI1蛋白自身并不是鈣離子通道，在信號級聯中是一個能夠通過第二信使活化的鉀離子通道。通過改變細胞核膜上的膜電位，進而激活核膜上的未知電壓門控型鈣離子通道[21,24]。也有另一種認為，DMI1可能扮演由反離子到鈣離子通道的作用[25]。

DMI1同源蛋白質家族都共同擁有RCK功能結構域。RCK是電導調節鉀離子(regulate the conductance of K+)結構域。晶體結構研究揭示，在細菌MthK鈣離子激活鉀離子通道(M.thermautotrophicumK+channel)中，C端的RCK結構域對通道的打開起主要作用。MthK復合體一共有8個RCK結構域，在細胞內膜表面形成一個門控環。4個RCK結構域屬于MthK全長的亞基，另外4個是可溶性結構域。當鈣離子結合到該結構域，則會導致通道離子門控打開[26-28]。在dmi1突變體和DMI1酵母表達的試驗中，DMI1的功能會隨 RCK結構域的改變而改變[21]。

無論是單子葉植物還是雙子葉植物都存在DMI1同源蛋白質，而目前在同源蛋白中僅有一小部分得到研究。在豆科模式植物百脈根的研究報道中，同源蛋白CASTOR和POLLUX的功能在叢枝菌根和根瘤菌共生體系中和DMI1類似，對細胞核鈣離子振蕩發揮著重要作用。電生理學和酵母互補分析研究表明CASTOR和POLLUX是鉀離子滲透型通道。GFP融合蛋白的實驗表明它們位于細胞核區域的核膜上[29]。POLLUX是更接近DMI1的基因，但是POLLUX在苜蓿中不能單獨完成和DMI1同樣功能。目前認為菌根因子和結瘤因子信號轉導是由CASTOR和POLLUX共同激活第二信使，使細胞核周區域鉀離子流入，最終導致超極化并激活未知門控電壓鈣離子通道[30]。豌豆(Pisumsativum)作物中同源蛋白SYM8在蒺藜苜蓿突變體中能夠互補DMI1的功能[31]。在非結瘤植物中也有DMI1的同源蛋白。研究發現水稻OsCASTOR和OsPOLLUX缺陷型突變體不能建立叢枝菌根共生體系。說明這兩個基因是叢枝菌根共生體系信號轉導中的重要原件。另外， OsPOLLUX能夠修復蒺藜苜蓿dmi1-1突變體的結瘤，但不能感染叢枝菌根[32]。

在內共生信號級聯通路Ca2+信號的下游，鈣調素CCaMK(也稱DMI3)(calcium-and-calmudulin-dependent protein kinase/ dose not make infection 3)位于細胞核，結合CYCLOPS互作，感知并解碼鈣振蕩信號[4,33]，對共生信號進行轉錄。轉錄因子NSP1(nodulation signalling pathway 1)和NSP2等誘導基因表達[34-36]，最終產生根瘤菌在植物根細胞的結瘤以及叢枝菌根在植物根細胞的生節反應，完成整個共生互作通路[37]。

2 植物與微生物脅迫互作的反面關系——植物防御體系

病原微生物(也就是病原菌)能夠與植物產生互作作用，對植物產生致病物質，造成各種感染性病害。例如，炭疽菌屬真菌(Colletotrichum)，能夠侵染大多數糧食作物和果蔬植物，致使其莖葉及果實等出現褐色病斑與褐色凹陷，最終導致死亡。不僅影響糧食、果蔬的品質和產量，而且給植物生長和繁殖造成毀滅性災害。

當植物遭受病原微生物脅迫入侵時，為保護自身不受病原菌的侵害，先天免疫系統(innate immunity)被激活，該系統是植物細胞內在復雜的防御反應網絡體系。植物先天免疫體系分為兩個部分[38]：Ⅰ.病原物激發植物細胞相關分子模式的免疫(PAMPs-triggered immunity，PTI)，即PAMP誘導免疫系統；Ⅱ.效應因子觸發的相關分子模式的免疫(effector-triggered immunity，ETI)，即效應誘導免疫系統。PTI是由基礎防御(basal defence responses)構成，能夠幫助植物抵御大部分病原微生物侵染。而ETI是依賴效應蛋白(effect protein)和防御蛋白(resistance protein， R-Protein)識別病原微生物分泌的效應子引發特異反應，例如過敏反應HR (hypersensitive response)，能使細胞程序性死亡[38-40]。

先天免疫系統信號通路是從植物細胞膜上的受體PRR (pattern-recognition receptor)識別病原菌微生物保守的分子模式PAMPs(pathogen-associated molecular patterns)開始的[39]。PAMPs分子不是病原微生物所特有的，而是廣泛存在于微生物中，例如，典型的PAMPs分子模式flg22和elf18，flg22是細菌鞭毛蛋白(flagellin)N端的22個氨基酸保守區域，該段氨基酸序列可以取代鞭毛蛋白的完整序列對植物引起刺激反應[41-43]。細菌延伸因子(EF-TU)與鞭毛蛋白類似，是一種非常保守的蛋白，elf18是乙酰化N端具有18個氨基酸的保守序列，可發揮EF-TU的全功能[44]。

在對受體PRRs研究中，已有被完整定義的受體蛋白。如，識別細菌鞭毛蛋白flg22的FLS2受體(flagellin sensing 2)和識別細菌延伸因子elg18的EFR受體(elongation factor tu receptor)，這2個PRR受體蛋白都富含亮氨酸的重復序列LRR(leucine-rich-repeat)受體蛋白激酶結構域，為LRR-type受體激酶[43,45-46]。同時，擬南芥BAK1受體(BRI1-associated receptor kinase 1)富含亮氨酸的重復序列LRR，能夠迅速與FLS2或者EFR形成共受體復合物結構，識別PAMPs進入細胞[47-50]。受體蛋白激酶BAK1(又稱SERK3)是雙元受體，既作為激素信號構成組件參與調控植物油菜素內脂BR的信號轉導，也是病原菌PRRs受體成員，參與病原菌信號轉導[51]。

在免疫系統信號級聯通路的分子機制早期，PAMPs誘導受體信號識別開啟信號級聯通路(如圖1，B 所示)。細胞膜上的離子通道對病原菌感知，鈣離子作為細胞質第二信使并瞬間向細胞質內流[8]，引起胞質鈣離子[Ca2+]cyt濃度瞬間提高，鈣離子濃度急劇增加甚至能持續增加幾分鐘[7,52]。目前在植物基因組中有57個編碼的離子通道[53]，大約有40個是屬于2組蛋白質家族的。他們分別是谷氨酸受體通道GLR(glutamate receptor)和環核苷酸門控通道CNGC(cyclic nucleotide gated channel)。GLRs的同源蛋白家族是發現于哺乳動物神經中樞系統的無選擇性配體門控離子通道(包括鈣離子)，植物GLRs已證實能夠轉導植物細胞的鈣離子[54]，但目前缺乏直接的證據來證明病原菌防御信號中胞質鈣離子信號產生是由GLRs引起的[55]。另一類植物離子通道CNGCs家族蛋白通道(即CNGC1-20)能結合被激活的環磷酸腺苷cAMP或者環磷酸鳥苷cGMP的通道蛋白。目前已經有大量證據證明植物免疫反應中，鈣離子信號與CNGCs調控有關，位于細胞膜上的環核苷酸離子通道家族CNGCs則負責病原菌信號通路釋放鈣離子到細胞質的作用[40]。

CNGC是非選擇性配體陽離子門控通道，其結構包括6個跨膜區和位于細胞質內多肽鏈C端的鈣調素結合區域(cyclic nucleotide binding domain，CNBD)[56]。CNBD是一個重疊結構域，參與環核苷酸的結合，又參與鈣調素蛋白的結合。受體PRRs激活分布在質膜或者胞質的核苷酸環化酶，環核苷酸的濃度得到上升后，激活了CNGC離子通道，使細胞質鈣離子濃度上升。研究發現，CNGC2和CNGC4的擬南芥功能缺失突變體苗dnd1(defence-no-death 1 mutant)和hlm1 (the HR-like lesion mimic 也稱作dnd2)能夠改變無毒性病原菌(Pseudomonassyringae)的侵染，突變體苗能夠修復過敏反應HR[57-60]。CNGC2和CNGC4已被證實能夠調控植物免疫系統級聯通路中細胞質鈣離子躍遷[5,56]。通過刪除了3 kb CNGC基因片段的突變體苗cpr22(constitutive expresser of pathogen related genes 22)的表現型能夠反映CNGC11/12 的基因型。cpr22突變體的研究結果表明，CNGC11/12能引起過敏反應(HR-like)導致細胞死亡，并發現該過程依賴鈣離子的細胞跨膜內流[61-63]。

科學家在對茄科作物西紅柿(Solanumlycopersicum)和馬鈴薯(Solanumtuberosum)的大量易感基因(susceptibility genes,Sgenes)的研究中，利用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術，將西紅柿和馬鈴薯中編碼了CNGC2的同源基因SlDND1和StDND1沉默失活。研究表明，RNAi突變體Sldnd1的新葉片和老葉片在沒有接種病原菌的情況下有自發的細胞壞死現象；而Stdnd1和擬南芥CNGC2突變體(也稱作Atdnd1)都具有侏儒型表現型，并且也有自發的細胞壞死現象[64]。結果證實，作物西紅柿和馬鈴薯的擬南芥CNGC2同源基因對晚疫病和白粉病具有廣譜抗性[64]。

近年來研究者還發現，植物細胞內如葉綠體等細胞器在生物脅迫條件下能夠誘導產生特異的Ca2+信號[65]。Nomura等通過煙草及擬南芥模式植物的研究認為外源PAMPs信號通過未知信號通路在細胞質鈣離子濃度[Ca2+]cyt瞬時提高之后約1～2 min，葉綠體基質的Ca2+濃度也隨之出現約10 min持續的增加[65]。定位于基粒膜上的鈣敏感受體結合蛋白CAS (calcium-sensing receptor) 參與了葉綠體Ca2+信號的傳遞。PAMPs分子模式中，CAS膜蛋白通過參與葉綠體Ca2+信號的傳遞，引起了煙草和擬南芥突變體免疫反應的基礎防御反應以及過敏反應 HR[66,67]。

鈣離子信號產生后被下游信號組件包括鈣調素CAM以及鈣調素結合蛋白CML(calmodulin-like protein)級聯有絲分裂原激活蛋白激酶MAPK(mitogen-activated protein kinase)、類鈣調神經磷酸酶B亞基蛋白CBL(calcineurin B-like protein)、鈣依賴型蛋白激酶CDPK(Ca2+-dependent protein kinases)等特異的解碼。鈣離子信號下游的其他信號如ROS被激活，NO隨之產生[40,68,69]，誘導基因表達。最終產生免疫應答，如過敏反應HR，胼胝質沉積(callose deposition)和幼苗生長抑制(seedling growth inhibition)[70]以及氣孔關閉隨之產生[71]。

3 展 望

在植物-微生物互作信號通路體系中，鈣離子作為細胞第二信使將外源刺激轉導形成特異的鈣信號，隨之將信號傳遞給下游解碼鈣信號的鈣感受蛋白，最終完成信號通路對微生物刺激信號的響應。研究發現，倘若在整個信號通路體系細胞膜系統上相應調控Ca2+信號轉導的通道蛋白缺失或失活，通路將不能實現對微生物刺激的反應應答，進而導致植物的特異生物學表現型(表1)。深入探索農作物中與Ca2+信號相關的同源蛋白，對農業育種及生產具有重要意義。迄今，植物-微生物互作體系中與Ca2+信號有關蛋白的研究已經取得了長足的進展。雖然調控Ca2+信號轉導的通道蛋白已經相繼得到鑒定和分離，但是研究結果尚不能完整詮釋外源微生物刺激是如何準確的在細胞內通過已知鈣通道蛋白產生特異Ca2+信號，細胞內Ca2+濃度又如何以時間、空間、頻率、幅度等形式表達Ca2+信號并特異地調控信號通路下游細胞生理應答反應等問題。在研究的過程中，一方面在不同的發育階段和不同的組織器官上外源微生物對不同種類植物的刺激具有差異性；另一方面各細胞信號轉導通路之間存在著復雜、多樣的信號系統相互作用，形成了信號轉導網絡(cross talk)，這為深入研究特異的Ca2+信號帶來了更多的挑戰。研究者們通過分子克隆、定點突變等方法，利用膜片鉗技術，對離子通道分子結構與生物學功能關系作深入研究；近年來，研究者們通過基因工程的方法將Ca2+生物熒光蛋白指示劑Yellow Cameleon (YC) 和aequorin(水母蛋白)轉入待研究野生型或轉基因植物體內，在植物細胞中建立能夠穩定表達YC熒光蛋白和水母蛋白的高效、快捷、穩定的科學實驗體系。通過構建的植物Ca2+生物熒光蛋白體系，結合鈣離子拮抗劑如EGTA、U73122、TMB-8等化學物質[9]，應用不同外源微生物激發子誘導植物產生鈣離子信號的瞬時變化，在植物整體和細胞水平上對實時、定點、動態、可視地檢測鈣離子信號的瞬時變化進行分析，為進一步揭示Ca2+信號的分子機制進行努力。綜上所述，對植物細胞Ca2+信號的研究，目前主要局限擬南芥、蒺藜苜蓿等模式植物種類中，通過基因工程建立植物-Ca2+生物熒光蛋白實驗體系，研究糧油作物和園藝作物等的同源Ca2+通道蛋白，具有前沿性和實踐意義。

表1 植物-微生物互相作中與鈣離子信號有關的通道蛋白

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(編輯:裴阿衛)

Regulation Molecular Mechanisms of Ca2+Signaling on Plant-Environmental Microorganism Interactions

GONG Xuefeng1, SONG Zhanfeng1*, MIAO Mingjun1, LI Yuejian2

(1 Horticulture Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China; 2 Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China)

Interactions between plant and environmental microorganism not only existed stress relationship but also possessed symbiotic relationship. Whether on plant-pathogen interaction system caused damage to plant or on plant symbiotic system provided nutrition for plant, the regulation molecular mechanism of Ca2+signaling in cell transduction pathways all played important roles. In this review, we focused on both interaction systems of regulation upstream mechanism of Ca2+signaling in the cell transduction pathway in details.

Ca2+signaling; symbiosis; pathogen; cell signaling transduction

1000-4025(2016)10-2128-09

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.10.2128

2016-06-17;修改稿收到日期:2016-09-19

四川省財政創新能力提升工程專項資金，青年基金項目(2016QNJJ-026)；四川省農作物育種攻關項目，突破性蔬菜(食用菌)新品種選育(2011N0098-7)

鞏雪峰(1983-)，女，博士，助理研究員，主要從事辣椒環境脅迫育種及分子生物學研究。E-mail：xuefenggong@qq.com

*通信作者:宋占鋒，學士，副研究員，主要從事辣椒遺傳育種研究。E-mail：289544274@qq.com

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