馬氏珠母貝近交與雜交家系的DNA甲基化多態(tài)性比較

羅少杰，張鵬飛，焦 鈺，王慶恒,2，杜曉東,2，鄧岳文,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

馬氏珠母貝近交與雜交家系的DNA甲基化多態(tài)性比較

羅少杰1，張鵬飛1，焦 鈺1，王慶恒1,2，杜曉東1,2，鄧岳文1,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2.廣東省珍珠養(yǎng)殖與加工工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

采用甲基化敏感多態(tài)性擴(kuò)增技術(shù)（MSAP）檢測馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）近交（F1）與雜交（Z1）家系閉殼肌的 DNA甲基化修飾水平，對部分甲基化修飾片段進(jìn)行回收、測序和注釋分析。結(jié)果表明：使用20對引物進(jìn)行選擴(kuò)增PCR，最終F1和Z1分別獲得（632.20 ± 22.58）和（588.60 ± 25.09）條條帶，差異顯著（P＜0.05）；F1和Z1之間的組織甲基化水平分別為（9.93 ± 1.60）%和（8.04 ± 1.25）%，差異顯著（P＜0.05）。對回收片段進(jìn)行注釋，F(xiàn)1家系共獲得9條甲基化修飾片段，其中8條為功能蛋白，分別為E3泛素連接酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒多聚蛋白、神經(jīng)肽受體、交叉結(jié)點核酸內(nèi)切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隱花色素蛋白、脆性位點相關(guān)蛋白；Z1家系共獲得5條甲基化修飾片段且均為功能蛋白，分別為脆性位點相關(guān)蛋白、神經(jīng)元乙酰膽堿受體α亞基、無調(diào)性的同源蛋白、麥芽糖酶、甲基胞嘧啶雙加氧酶。初步闡明馬氏珠母貝近交家系F1與雜交家系Z1間的DNA甲基化修飾水平和部分具甲基化修飾位點。

馬氏珠母貝；近交家系；雜交家系；MSAP

在育種學(xué)中，雜交是改良動、植物種質(zhì)的重要手段，能使兩個具不同遺傳背景的親本產(chǎn)生的雜種子一代在生長勢、生活力、生殖力、產(chǎn)量和品質(zhì)等方面優(yōu)于雙親或親本的一方，即雜種優(yōu)勢[1]。目前，越來越多的研究表明雜種子一代的優(yōu)良性狀表現(xiàn)與基因表達(dá)有直接聯(lián)系[2-3]，而基因表達(dá)又受到諸如基因組 DNA甲基化分布及水平[4]、組蛋白修飾等的協(xié)同調(diào)控。其中，DNA甲基化是真核生物DNA最常見的復(fù)制后調(diào)控方式之一。其由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）起介導(dǎo)作用，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，提供硫代蛋氨酸，將甲基轉(zhuǎn)移到其他的化合物上，進(jìn)而隨著DNA甲基化水平的變化而改變DNA穩(wěn)定性、構(gòu)象或染色體結(jié)構(gòu)等，最終達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的目的。此外，Hepburn[5]等指出自交會導(dǎo)致甲基化水平逐步積累，而雜交則能夠解除基因組的甲基化修飾。這意味著DNA甲基化、基因表達(dá)與雜種優(yōu)勢的表現(xiàn)間存在著一定的內(nèi)在聯(lián)系。

為深入了解DNA甲基化在生物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制和作用，目前已有多種方法分別從基因到基因組各個層次對之進(jìn)行研究。其中Reyna-López[6]在1997年報道的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP）由于操作簡便、條帶具高多態(tài)性等優(yōu)點，而成為檢測基因組DNA甲基化水平的有效手段。其原理是通過一對對胞嘧啶甲基化修飾敏感性不同的同裂酶（MspⅠ/Hpa Ⅱ）對基因組進(jìn)行酶切，通過預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增等多個步驟獲得甲基化敏感多態(tài)性譜帶，而后分析得到組織甲基化水平。目前該技術(shù)已被應(yīng)用于櫛孔扇貝（Chlamys farreri）[7]、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）[8]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[9]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]等多個經(jīng)濟(jì)物種的基因組DNA甲基化研究中。

馬氏珠母貝（Pinctada fucata martensii）又稱合浦珠母貝，是中國重要的海水珍珠培育貝類之一。由于長期的近親繁育、累代養(yǎng)殖以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導(dǎo)致了珍珠貝出現(xiàn)生長緩慢、性狀下降等問題，因此通過選育出具抗逆性、高生長性能的群體是珍珠貝產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要出路，但選育背后所隱含的分子機(jī)制尚未清楚。本研究通過分析馬氏珠母貝近交與雜交家系的DNA甲基化水平，同時對部分甲基化修飾片段進(jìn)行回收、注釋，以期探明馬氏珠母貝近交家系F1和雜交家系Z1間的DNA甲基化修飾水平和部分具甲基化修飾序列，為馬氏珠母貝遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 實驗所用的馬氏珠母貝自交和雜交材料構(gòu)建于2012年4月，采用因子設(shè)計構(gòu)建法，親本來自于兩個全同胞家系（A與B）。A1♀ × A2♂構(gòu)成近交家系（F1）；A1♀ x B1♂構(gòu)成雜交家系（Z1）。養(yǎng)殖與管理方法按照常規(guī)技術(shù)在徐聞縣大井村珍珠養(yǎng)殖基地吊養(yǎng)。

在F1和Z1中分別選取20個大小規(guī)格較為一致的馬氏珠母貝，其中 F1（38.01 ± 7.13）g，Z1（37.52 ± 8.63）g，在清凈的海水中暫養(yǎng)2 d后取樣。MSAP分析使用閉殼肌組織，固定于體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇水溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參照Xiong等[11]和于濤等[7]在玉米、扇貝中等使用的方法分別設(shè)計接頭引物、預(yù)擴(kuò)增PCR引物、選擴(kuò)增PCR接頭（表1），并在實驗過程中分別對酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增及選擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系和條件等進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 提取組織DNA及RNA 使用Thermo Fisher Scientific的 DNA提取試劑盒，參照貝類基因組DNA提取法[12]，分別提取F1、Z1個體閉殼肌組織DNA。挑取高質(zhì)量的DNA，按照每4個DNA混為一個樣的原則，將F1、Z1個體DNA分別混合，而后進(jìn)行下一步實驗操作。

1.2.3 MSAP過程 酶切反應(yīng)：分別用 EcoRⅠ + MspⅠ、EcoRⅠ + Hpa Ⅱ?qū)ν粋€DNA樣品進(jìn)行酶切。EcoRⅠ+ MspⅠ反應(yīng)體系包括0.5 μg DNA，2.5μL CutSmart，1μL EcoRⅠ，1μL MspⅠ，余下體積用滅菌ddH2O補(bǔ)至25μL；EcoRⅠ + Hpa Ⅱ則將上述體系中的MspⅠ替換為Hpa Ⅱ即可。反應(yīng)條件為37℃金屬浴6 h；65℃滅活30min，而后瓊脂糖凝膠檢測酶切效果。

表1 引物序列Table 1 The Primer sequence

連接反應(yīng)：取等體積接頭引物EcoRⅠ（10 pmol）和MH（100 pmol）充分混合，而后置于94℃變性5min，4℃保存?zhèn)溆谩＿B接體系包括10μL酶切產(chǎn)物，3μL混合的接頭引物，8μL SolutionⅠ，4μL ddH2O。反應(yīng)條件為16℃，12 h。連接產(chǎn)物稀釋20倍后4℃保存留待預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)使用。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)可分為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)和選擴(kuò)增反應(yīng)。其中預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系包括5μL連接產(chǎn)物，1μL Pre-EcoRⅠ，1μL Pre-MH，12.5μL PAGE-Mix，5.5μL ddH2O。反應(yīng)條件為94℃，2min；94℃，30 s；52.5℃，30 s；72℃，1min；合計25個循環(huán)，72℃，8min。瓊脂糖凝膠檢測時，泳道呈現(xiàn)彌散帶則表明反應(yīng)條件合適，將之稀釋20倍后4℃保存。

選擴(kuò)增反應(yīng)體系與預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)一致，反應(yīng)條件為94℃，2min；94℃，30 s；65℃，30 s，72℃，1min；合計13個循環(huán)；94℃，30 s；56℃，30 s；72℃，1min；合計23個循環(huán)；72℃，8min；4℃保存。瓊脂糖凝膠檢測時見泳道中具多條特異性條帶即可使用聚丙烯酰胺凝膠分離選擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠 使用0.06 g/mL的聚丙烯酰胺凝膠分離選擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)選擴(kuò)增產(chǎn)物在泳道上的情況，可將之分為3個不同類型[13]（圖1）。Ⅰ型為Hpa Ⅱ和MspⅠ泳道均有帶，代表非甲基化（A）；Ⅱ型為Hpa Ⅱ無帶，MspⅠ有帶，代表全甲基化（B）；Ⅲ型則是Hpa II有帶，Msp I無帶，代表半甲基化（C）。所有引物擴(kuò)增條帶數(shù)（D）：D=A + B + C；組織甲基水平=[（B+C）/D]；全甲基化水平 =（B/D）；半甲基化水平=（C/D）；非甲基化水平 =（A/D）。

各類型及組織甲基化百分比率均用平均值±方差表示；用t-檢驗進(jìn)行顯著性分析。

1.2.5 對特異性的甲基化修飾片段進(jìn)行回收、克隆、測序、篩選和比對 回收聚丙烯酰胺凝膠上重復(fù)、清晰，且具特異性修飾（全甲基化修飾或半甲基化修飾）位點，分別加入30μL ddH2O，沸水浴20min，吸取上清后輔以相應(yīng)引物及PCR條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物再次酶切后，仍為明亮單一條帶，則說明 MSAP過程中的酶切反應(yīng)完全，可用pMD-19T連接，DH5α轉(zhuǎn)化，挑取陽性單克隆菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，而后通過在線Blast網(wǎng)站和本地Blast程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA甲基化修飾水平分析

20對引物擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，結(jié)果顯示引物擴(kuò)增效果好，均能獲得譜帶清晰且重復(fù)、甲基化多態(tài)性高的圖譜（圖1）。

圖1 不同個體的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠檢測Fig.1 Selective amplification products were detected by agarose gel

自交家系F1和雜交家系Z1產(chǎn)生的甲基化數(shù)據(jù)信息見表2。F1在全甲基化位點數(shù)目和組織甲基化總數(shù)上顯著高于Z1，但二者在半甲基化位點數(shù)目和非甲基化位點數(shù)目上均沒有顯著性差異。

表2 甲基化條帶數(shù)Table 2 The data of DNA methylation

自交家系F1和雜交家系Z1的各類型甲基化位點比例列于表3。F1的全甲基化位點比例和組織甲基化水平均顯著高于雜交家系 Z1，但雜交家系 Z1的非甲基化位點比例卻顯著高于自交家系F1的。自交家系F1和雜交家系Z1在半甲基化位點比例上沒有顯著差異。

表3 各甲基化類型位點在馬氏珠母貝各組織中的比率Table 3 The percentage of DNA methylation type in difference tissues of Pinctada martensii %

2.2 具甲基化修飾片段分析

對回收片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測序及序列比對，而后使用在線Blast網(wǎng)站和本地Blast程序進(jìn)行同源性比對：F1共獲得9條具甲基化修飾片段，其中有8條片段能夠在馬氏珠母貝基因組數(shù)據(jù)中找到對應(yīng)全長序列。經(jīng)Blastn注釋為E3泛素連接酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒多聚蛋白、神經(jīng)肽受體、交叉結(jié)點核酸內(nèi)切酶、磷酸糖器、苯丙氨酸解氨酶、隱花色素蛋白、脆性位點相關(guān)蛋白；Z1共獲得5條甲基化修飾片段，均能在馬氏珠母貝基因組數(shù)據(jù)庫中找到對應(yīng)全長序列。經(jīng) Blast注釋為脆性位點相關(guān)蛋白、神經(jīng)元乙酰膽堿受體α亞基、無調(diào)性的同源蛋白、麥芽糖酶、甲基胞嘧啶雙加氧酶。結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠，標(biāo)出各個片段在 F1、Z1所具有的甲基化類型（表4—5）。

表4 F1回收序列比對結(jié)果Table 4 The results of comparison by Transcriptome

表5 Z1回收序列比對結(jié)果Table 5 The results of comparison by Transcriptome

結(jié)合表 5、圖2可發(fā)現(xiàn)，盡管Sequence 9和Sequence 10均屬于脆性位點相關(guān)蛋白，但其在F1和Z1中的片段長度及類型并不一樣，F(xiàn)1中為半甲基化，Z1中為全甲基化。

3 討論

DNA甲基化作為表觀遺傳的重要組成部分，其在基因印跡[14]、染色體的維持[15]、基因表達(dá)[16]等多個生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[17]。Xiong等[11]最早使用MSAP技術(shù)分析了水稻的甲基化水平，姜群等[8]通過F-MSAP對太平洋牡蠣的不同組織的甲基化水平進(jìn)行分析，證明了MSAP檢測結(jié)果是有效、可靠的。本實驗通過MSAP技術(shù)分析了馬氏珠母貝近交與雜交家系的閉殼肌甲基化水平和模式，近交家系F1的組織甲基化水平顯著高于雜交家系Z1，這與櫛孔扇貝[7]、肉牛[18]、豬[19]等關(guān)于 DNA甲基化與雜交關(guān)系的結(jié)論相似：雜交子代的甲基化水平低于自交子代。通常認(rèn)為自交并沒有改變甲基化率，但雜交在保持大部分甲基化模式穩(wěn)定傳遞的同時，還進(jìn)行豐富的甲基化和去甲基化變化，并在環(huán)境的參與下形成一個綜合雙親性狀并生存的狀態(tài)，這正是導(dǎo)致近交、雜交子代的DNA甲基化修飾水平存在差異的主要原因。

研究認(rèn)為雜交子代所具有的雜種優(yōu)勢可能是組織甲基化水平降低所致[20]。一般來說，雜種優(yōu)勢的形成涉及到大量基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉、基因間、基因與環(huán)境之間的相互作用，這是一個復(fù)雜的調(diào)控過程。在這個過程中，并非所有的基因的甲基化狀態(tài)都發(fā)生改變，而是以DNA甲基化為主的協(xié)同機(jī)制確定最終的基因表達(dá)。本研究中，兩個家系共比對上14條存在DNA甲基化修飾的基因組序列，可以發(fā)現(xiàn)回收序列中有個別序列的甲基化狀態(tài)并未發(fā)生變化，如泛素連接酶、逆轉(zhuǎn)錄病毒多聚蛋白等；亦有諸如脆性位點相關(guān)蛋白基因，其在自交家系F1中呈現(xiàn)半甲基化修飾，但在Z1中呈現(xiàn)全甲基化修飾，并且其修飾長度亦不同。一般認(rèn)為雜交是利用現(xiàn)有的基因和性狀進(jìn)行重新組合，將甲基化程度解除或重新編排，而后產(chǎn)生新的基因型和表型[21]；同時，基因的不同甲基化模式是相對應(yīng)于不同的轉(zhuǎn)錄水平和功能[22]，進(jìn)而使得基因在表達(dá)的過程中更加穩(wěn)定可控。因此，脆性位點相關(guān)蛋白DNA在雜交過程中被予以新的甲基化狀態(tài)，即全甲基化，推測這能夠調(diào)控基因表達(dá)，但這還需要進(jìn)一步的實驗驗證。Xiong等[11]認(rèn)為在產(chǎn)生雜種優(yōu)勢的過程中，某些位點的甲基化修飾降低對雜種優(yōu)勢有利，某些位點的甲基化修飾增強(qiáng)對雜種優(yōu)勢亦有利。熊立仲等[23]利用一套雙列雜交組合的劍葉進(jìn)行研究，也得到相同的結(jié)論。可見，DNA甲基化與雜種優(yōu)勢并非是單一的線性關(guān)系，可能還有其他的表觀遺傳修飾的協(xié)調(diào)表達(dá)，因此還需要結(jié)合遺傳基礎(chǔ)、基因表達(dá)調(diào)節(jié)等學(xué)科知識方能最終揭示雜種優(yōu)勢的生物學(xué)基礎(chǔ)。

據(jù)報道，水產(chǎn)動物的DNA甲基化水平通常在20%～50%左右。尼羅羅非魚[9]為23.74%；背角無齒蚌[24]鰓組織為 47.9%，唇瓣為 35.5%，閉殼肌為50%，外套膜為 46.3%；櫛孔扇貝、海灣扇貝、蝦夷扇貝、蝦夷扇貝海大金貝[25]分別為 32.08%、25.99%、32.88%和 34.97%等。但本實驗結(jié)果顯示F1、Z1的組織甲基化水平遠(yuǎn)低于平均，這可能與物種或組織特異性、年齡、環(huán)境差異等有關(guān)。同時，由于 F1、Z1的全甲基化水平顯著高于半甲基化水平，因此可以判定F1、Z1的甲基化模式主要是CpG型，這與目前多數(shù)水產(chǎn)動物的研究結(jié)果類似。

目前，關(guān)于雜種優(yōu)勢的分子機(jī)制尚未透徹，不能判定馬氏珠母貝的DNA甲基化水平降低就必然產(chǎn)生雜種優(yōu)勢，它們之間的關(guān)系需要將來更多的結(jié)果來佐證。

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（責(zé)任編輯：陳莊）

Comparison of DNA Methylation Polymorphisms BetweenⅠnbred and Hybrid Families of Pinctada fucata martensii

LUO Shao-jie1，ZHANG Peng-fei1，JⅠAO Yu1，WANG Qing-heng1,2，DU Xiao-dong1,2,DENG Yue-wen1,2
（1.Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Guangdong Technology Research Center for Pearl Aquaculture and Process,Zhanjiang 524025,China）

Methylation-sensitive amplification polymorphism（MSAP）technology was used to analyze the methylation levels of adductor muscle from the inbred family（F1）and the hybrid family（Z1）of Pinctada fucata martensii.Meanwhile，specific methylation fragments were extracted，sequenced and annotated.The results showed that，（1）（632.2 ± 22.58）and（588.60 ± 25.09）clear and repetitive DNA bands were obtained by using 20 pairs of primers from F1and Z1，respectively.The percentages of methylation levels were（9.93 ± 1.60）% in F1and（8.04 ± 1.25）% in Z1（P＜0.05）.（2）After the specific bands had been extracted and sequenced,nine methylation fragments were obtained from F1,including eight annotated sequences,such as E3 ubiquitin-protein,Retrovirus polyprotein,Neuropeptide F receptor,Crossover junction endonuclease,Sugar phosphate exchanger,Phenylalanine ammonia-lyase,Cryptochrome and Fragile site-associated protein in F1.And five methylation fragments was obtained from Z1，and were annotated as Fragile site-associated protein,Neuronal acetylcholine receptor,Proteinatonal homolog,Maltase-glucoamylase and Methylcytosine dioxygenase.These results are helpful to elucidate the function of methylation inheterosis,providing the theoretical basis for the aquaculture breeding research in pearl oyster P.fucata martensii.

Pinctada fucata martensii; inbred; hybrid; methylation-sensitive amplification polymorphism

S917.4

A

1673-9159（2016）06-0009-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.002

2016-06-14

國家自然科學(xué)基金(31672626)；廣東省科技計劃（2015A030302079）；廣東省海洋漁業(yè)局項目（Z2014009）

羅少杰（1991—），男，碩士研究生，研究方向為海洋生物學(xué)。E-mail：rogerjoke1@hotmail.com

鄧岳文，男，教授，研究方向為貝類遺傳育種與養(yǎng)殖。E-mail：dengyuewen@sohu.com; Tel：0759-2383346