響應面法優化南極磷蝦酶法制備DPP-ⅠⅤ抑制肽工藝條件的研究

吉 薇，章超樺,，吉宏武,

（1.廣東海洋大學食品科技學院 // 2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室 // 3.水產品深加工廣東普通高校重點實驗室,廣東 湛江524088）

響應面法優化南極磷蝦酶法制備DPP-ⅠⅤ抑制肽工藝條件的研究

吉 薇1，章超樺1,2,3，吉宏武1,2,3

（1.廣東海洋大學食品科技學院 // 2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室 // 3.水產品深加工廣東普通高校重點實驗室,廣東 湛江524088）

采用動物蛋白水解酶酶解制備南極磷蝦二肽基肽酶-ⅠⅤ (DPP-ⅠⅤ)抑制肽，以DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白含量為主要指標，考察溫度、反應時間、pH、酶添加量對南極磷蝦的酶解效果。在單因素的基礎上，依據中心組合實驗設計原理，運用4因素3水平的響應面分析法，建立動物蛋白水解酶酶解南極磷蝦制備DPP-ⅠⅤ抑制肽的二次多項式數學模型，并以DPP-ⅠⅤ抑制率為響應值作響應面。結果表明：南極磷蝦酶法制備DPP-ⅠⅤ抑制肽的最佳工藝參數為酶解時間3.85 h、溫度45.02℃、pH值7.58、酶添加量237.55 U/g原料；在此條件下，酶解液DPP-ⅠⅤ抑制率的預測值為64.82%，驗證值為64.78%，優化方法可行。

南極磷蝦；DPP-ⅠⅤ抑制肽；響應面；工藝參數優化

隨著人們生活水平提高，糖尿病的發病率逐年上升，已成為繼癌癥、心腦血管疾病之后的第3位嚴重危害人類健康的慢性疾病[1]。據國際糖尿病聯盟（ⅠDF）統計，2014年我國作為世界上糖尿病患者人數最多的國家，患者人數接近1億。糖尿病可導致一系列的并發癥(包括神經病變、腎病、視網膜病變以及心血管疾病等)[2]。糖尿病分為Ⅰ型糖尿病（Type1 diabetes mellitus,T1DM）和Ⅱ型糖尿病（Type2 diabetes mellitus,T2DM）兩種類型。Ⅰ型糖尿病即胰島素依賴性糖尿病，是源于多種因素引起的自身免疫機制紊亂所導致的胰島β細胞破壞、胰島素分泌缺乏，是兒童及青少年最常見的一種內分泌疾病。Ⅱ型糖尿病即非胰島素依賴性糖尿病，是由胰島β細胞功能低下，胰島素相對缺乏而導致。在糖尿病患者中，Ⅱ型患者糖尿病患者至少占患者總數的95%[3]。目前，Ⅱ型糖尿病及其并發癥的預防與治療已引起全球范圍內的廣泛關注。胰高血糖素樣肽-1（glucagons-like peptide-1,GLP-1）是一種腸促胰島素，它通過刺激和保護胰島β細胞，促進胰島素的合成和分泌，降低餐后血糖。二肽基肽酶-ⅠⅤ（DPP-ⅠⅤ）抑制劑能裂解包括胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和抑胃肽（GⅠP）在內的多種肽類激素，降低Ⅱ型糖尿病患者的高血糖癥狀。因此，可以通過研發DPP-ⅠⅤ抑制劑來抵抗DPP-ⅠⅤ對腸促胰島素的降解，間接調節胰島素的分泌，從而達到調節血糖的目的[4]。目前，雖然人工合成的DPP-ⅠⅤ抑制劑（包括維達列汀和沙格列汀等）已應用于Ⅱ型糖尿病的治療，并具有良好的療效，但仍易引發諸如肝功能異常和過度低血壓等一系列的副作用[5]。因此，積極開發來源于食物中的安全、天然、高效的DPP-ⅠⅤ抑制劑己成為急需解決的問題。來源于各種食物原料的DPP-ⅠⅤ抑制肽已有許多報道。1980年，Kayoko M.Fukasawa首次從豬的肝臟和腎臟中提取出了DPP-ⅠⅤ抑制肽[6]。隨后關于DPP-ⅠⅤ抑制肽的研究逐漸增多。至今，人們已發現來源于海藻[7]、谷物[8]、南瓜[9]等植物原料的酶解產物和來源于牛奶[10]、乳清蛋白[11-12]、火腿[13]、金槍魚[14]等動物原料的酶解產物中都廣泛存在有DPP-ⅠⅤ抑制肽。但是，利用蝦、蟹等甲殼類動物蛋白制備DPP-ⅠⅤ抑制肽鮮有文獻報道。

南極磷蝦（Euphausua superb）是一種小型的甲殼類動物，生物量大。據統計，南極磷蝦生物總量為10～30億t，年可捕撈量為0.6～1億t[15]。南極磷蝦蛋白質含量豐富，為完全蛋白質，富含人體所需的9種必需氨基酸（包括嬰兒所需的組氨酸），其必需氨基酸含量符合1985年FAO/WHO/UNU報告中所推薦的氨基酸攝入量。南極磷蝦蛋白質為高品質蛋白質源[16]。目前，國內外對南極磷蝦利用的研究主要圍繞著蛋白質、磷蝦油及甲殼素等3大組分開展[17-19]。關于南極磷蝦生物活性肽的研究報道還較少，南極磷蝦蛋白酶解產物DPP-ⅠⅤ抑制活性的相關研究國內外尚無報道。本研究旨在運用動物蛋白水解酶，優化制備南極磷蝦DPP-ⅠⅤ抑制肽的最佳工藝參數，為南極磷蝦蛋白的深度開發與高值化利用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料 南極磷蝦(Euphausua superb)，由中國水產總公司提供。南極磷蝦水分含量為76.82%，蛋白含量為 16.80%，脂肪含量為 2.05%，總糖含量0.81%，灰分含量為3.52%。

1.1.2 實驗試劑 DPP-ⅠⅤ抑制劑篩選試劑盒購自Sigma公司；Folin-酚試劑購自北京鼎國生物科技有限公司；動物蛋白水解酶購自廣西南寧龐博生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 Ⅴarioskan Flash 酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司；Cary60分光光度計，美國安捷倫公司；T18高速分散機ULTRA- TURRAX，德國ⅠKA公司；雷磁PHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；JB50-D型增力電動攪拌機，上海精科儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 南極磷蝦蛋白酶解方法 取出冷凍的南極磷蝦，室溫放置解凍，蝦和水按一定的質量比混勻，經T18高速分散機分散均勻，預熱至酶解溫度，調到一定的pH值，加入酶啟動酶解反應，反應過程中維持溶液的pH值恒定。反應結束后，95℃水浴15min滅酶，冷卻至室溫，100目雙層紗布過濾，取濾液，測定DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白含量。

1.2.2 DPP-ⅠⅤ抑制率測定 采用試劑盒法（熒光法）對DPP-ⅠⅤ抑制率進行測定[20]。依次將30μL緩沖液、10μL DPP-ⅠⅤ、10μL溶劑、10μL抑制劑加入酶標板混勻，加入50μL底物啟動反應。37℃孵育15min，熒光檢測（激發波長360 nm，發射波長460 nm）。記錄結果，按如下計算公式得出DPP-ⅠⅤ抑制肽的抑制率。抑制率 =（F樣品- F對照）/ F對照× 100%。

1.2.3 可溶性蛋白測定 可溶性蛋白采取試劑盒法（Folin-酚試劑）進行測定[21]。先在試管中加入1mL待測樣品（稀釋后），再加入5mL Folin-酚試劑甲，室溫下靜置10min，加入0.5mL Folin-酚試劑乙，搖勻，室溫下靜置30min，在分光光度計上（500 nm）測定吸光值。空白以1mL蒸餾水代替，其余操作相同。將測定的吸光值代入標準曲線方程，計算其蛋白濃度。

1.2.4 單因素實驗

1）酶解溫度的確定。選用動物蛋白水解酶，酶解溫度分別為 35、45、55、65、75℃，在加酶量225 U/g原料，pH 7.5，m蝦∶m水=1∶1條件下，酶解 4 h后，研究不同的酶解溫度對酶解產物的DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響。

2）酶解時間的確定。選用動物蛋白水解酶，酶解時間分別為 1、2、3、4、5、6 h，在加酶量225 U/g原料，溫度為50℃，pH 7.5，m蝦∶m水=1∶1的條件下研究酶解時間的變化對酶解產物的 DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響。

3） pH的確定。選用動物蛋白水解酶，酶解pH分別為6、6.5、7、7.5、8、8.5，在加酶量為225 U/g，溫度為50℃，m蝦∶m水=1∶1的條件下，酶解4 h后，研究不同的pH對酶解產物的DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響。

4）酶解添加量的確定。選用動物蛋白水解酶，加酶量分別為150、225、300、375、450、525、600 U/g，溫度為50℃，pH 7.5，m蝦∶m水=1∶1的條件下，酶解4 h后，研究不同的酶添加量對酶解產物的DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響。

1.2.5 酶解工藝優化 根據 Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，基于單因素試驗結果，以酶解時間（A）、酶添加量（B）、溫度（C）、pH（D）為影響因素，酶解液DPP-ⅠⅤ抑制率（Y）為響應值，采用4因素3水平的響應面分析法進行實驗設計，因素和編碼水平見表 1。結果運用 Design-Expert 8.0.5.0軟件進行數據處理和響應曲面分析。

表 1 Box-Benhnken實驗因素水平與編碼Table 1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

1.3 統計分析

所得數據采用SPSS 9.0軟件進行數據統計分析，以α=0.05和α=0.01作為差異顯著水平。結果用± SD表示。若有顯著性差異（P＜0.05），則采用Duncan進行多重比較檢驗。

2 結果與討論

2.1 南極磷蝦酶解單因素條件研究

2.1.1 溫度對DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白的影響

由圖1可以看出，在35℃到45℃，可溶性蛋白含量和DPP-ⅠⅤ抑制率呈遞增趨勢，當酶解溫度達到45℃時，DPP-ⅠⅤ抑制率達到最大值。從45℃到 75℃，隨著溫度的增加，可溶性蛋白含量和DPP-ⅠⅤ抑制率都呈下降趨勢。李明杰[22]通過正交試驗確定了木瓜蛋白酶水解南極磷蝦的最佳酶解工藝，其中，溫度對酶解效果也呈先上升后下降的趨勢。這是因為溫度較低時，酶活性較小，水解速度較慢，可溶性蛋白和DPP-ⅠⅤ抑制率都較低；當溫度升后，酶活性變大，此時蛋白質結構展開，酶與底物充分反應，水解速度加快，可溶性蛋白和DPP-ⅠⅤ抑制率都有所增大；當溫度進一步升高，酶逐漸失去活性，水解速度變慢，酶解液中釋放的多肽量減少，可溶性蛋白和DPP-ⅠⅤ抑制率逐漸減小。本研究考慮到 45℃后，可溶性蛋白無顯著性差異（P＞0.05），DPP-ⅠⅤ抑制活性逐漸降低，且差異性顯著（P＜0.05），因此選擇45℃進行后續實驗。

圖1 溫度對DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響Fig.1 The effect of temperature on DPP-ⅠⅤ inhibitory activity and soluble protein of the enzymatic hydrolysate

2.1.2 時間對DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白的影響

從圖2可看出，酶解1～4 h，隨著酶解時間的延長，可溶性蛋白含量和DPP-ⅠⅤ抑制率都呈遞增趨勢，且到 4 h時 DPP-ⅠⅤ抑制活性達到最大值66.16%，酶解4～6 h時，隨著酶解時間的延長，DPP-ⅠⅤ抑制活性逐漸降低，可溶性蛋白含量緩慢增加，無顯著性差異（P＞0.05）。LACROⅠXⅠM[12]使用胃蛋白酶從乳清分離蛋白中酶法制備DPP-ⅠⅤ抑制肽時，隨著酶解時間的延長，DPP-ⅠⅤ抑制活性的先增加，后緩慢降低。這是因為啟動反應后，隨著時間延長，蛋白質水解生成肽的含量增多，DPP-ⅠⅤ抑制肽的抑制率和可溶性蛋白含量也隨之增大。當達到最大值后，隨著時間延長，蛋白質水解成的肽進一步水解成氨基酸，抑制肽的數量也隨之減少，可溶性蛋白含量無顯著性增加。

圖2 時間對酶解產物DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響Fig.2 The effect of different enzyme time on the DPP-ⅠⅤinhibitory activity and soluble protein of the enzymatic hydrolysate

2.1.3 pH對DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白的影響

由圖3可以看出，pH值在6～7.5時，隨著pH升高，DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白含量都增加，pH值為7.5時，兩項指標都達到最大值，pH在7.5～8.5時，隨著pH的增大，DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白含量逐漸變小。張居明[23]用響應面法優化牛乳中酪蛋白磷酸肽的制備工藝，不同pH條件下的水解度的變化趨勢也呈先出先增加，到達最大值后逐漸下降，與本研究相一致。這是因為，每種酶都有最適pH值，若pH值偏小或偏大都會破壞酶的結構，導致酶的反應速率受到抑制，從而影響DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白的含量。

圖3 pH對酶解產物DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響Fig.3 The effect of different pH on the DPP-ⅠⅤ inhibitory activity and soluble protein of enzymatic hydrolysate

2.1.4 酶添加量對 DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白的影響 從圖4可知，當酶添加量在150～225 U/g范圍，隨著酶添加量的增加，DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白含量逐漸增大，且在225 U/g達到最大值。當酶添加量在225～600 U/g范圍內，隨著酶添加量的增加，DPP-ⅠⅤ抑制率逐漸降低，可溶性蛋白含量增加緩慢，沒有極顯著性的差異變化。這與Nongonierma AB[24]酶解制備DPP-ⅠⅤ抑制肽時的結論相類似。在酶添加量較少時，酶添加量對DPP-ⅠⅤ抑制效果呈正相關關系，當酶添加量繼續增加時，DPP-ⅠⅤ抑制率逐漸減小。這是因為在酶添加量較小時，隨著酶量的增多，蛋白質分解逐漸完全，DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白含量也逐漸增大。當酶添加量達到225 U/g，此時酶分子相對于底物來說已趨向飽和，DPP-ⅠⅤ抑制率和可溶性蛋白含量達到最大值，繼續增大加酶量，由于在酶的作用下，蛋白分子水解完全導致具有DPP-ⅠⅤ抑制活性的多肽分子減少，DPP-ⅠⅤ抑制率逐漸降低。

圖4 酶添加量對酶解產物DPP-ⅠⅤ抑制活性和可溶性蛋白的影響Fig.4 The effect of different enzyme amount on the DPP-ⅠⅤinhibitory activity and soluble protein of enzymatic hydrolysate

2.2 響應面法優化酶解條件

2.2.1 中心組合試驗結果 按照表1設計進行試驗的結果見表2，根據表2的結果，以DPP-ⅠⅤ抑制率為響應值，通過Expert 8.0.5.0軟件對響應值與各因素的編碼值進行回歸擬合后，得到如下回歸方程：Y=64.65 - 0.62A + 0.47B - 0.33C + 0.87D + 0.022AB - 1.16AC + 1.19AD - 0.028BD - 0.97CD -2.35。對回歸方程方差分析的結果見表 3。從表 3中看出，對響應值所建立的回歸方程模型具有高度的顯著性(P＜0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.060 8＞0.05)，模型R2=0.966 3，說明該模型與實際實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著，試驗誤差小，因此可用該模型來分析和預測南極磷蝦酶解制備DPP-ⅠⅤ抑制肽工藝效果。回歸方程中各因素的系數值可以直接反映各試驗因子對指標值的影響程度。由各因素均方值可知，各因素對 DPP-ⅠⅤ抑制率的影響順序為：pH＞時間＞酶添加量＞溫度。從表3可以看出，方程的一次項A和D以及二次項A2、B2、C2和D2均是極顯著的；交互項中的AC和AD也對DPP-ⅠⅤ抑制率有顯著的影響，這說明響應值的變化十分復雜，各個具體的試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次關系。分別將模型中的 A(時間)、 B(酶添加量)、C(溫度)和pH其中一個因素固定在0水平，得到另外2個因素交互作用對DPP-ⅠⅤ抑制率的子模型，根據模型得到三維曲面圖，對抑制率有顯著影響的交互項 AC和AD的三維曲面圖由圖5—6表示。根據中心組合實驗所得的結果和二次多項回歸方程，用軟件Design-Expert 8.0.5.0得出獲得最大DPP-ⅠⅤ抑制率時各個因素的最佳酶解條件為：時間3.85 h、溫度45.02℃、pH值7.58、酶添加量237.55 U，此條件下DPP-ⅠⅤ抑制率的理論值為 64.82%。

表 2 Box-Benhnken實驗設計與結果Table 2 Box-Benhnken design matrix and experimental results

表 3 方差分析Table 3 the table of variance analysis

圖5 時間和溫度對DPP-ⅠⅤ抑制率影響的響應曲面Fig.5 Response surface plot of products of different time and temperature on DPP-ⅠⅤ inhibitory activity

圖6 時間與pH對DPP-ⅠⅤ抑制率影響的響應曲面Fig.6 Response surface plot of different time and pH on DPP-ⅠⅤ inhibitory activity

2.2.2 響應面等高線和響應曲面圖分析 等高線的形狀反映交互作用的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[25]。從圖5可知當溫度固定在零水平時，時間對DPP-ⅠⅤ抑制率的影響呈先緩慢增加后逐漸減少的趨勢。當固定時間因素，溫度對DPP-ⅠⅤ抑制率的變化趨勢也一致。當達到響應面曲面的最高點時即為DPP-ⅠⅤ抑制率的最佳值。投射對應下等高線圖即為橢圓的中心點。此時對應的時間和溫度即為酶解的最佳時間和溫度條件。從圖6可知，時間和pH因素的響應面等高線圖和圖5類似，都有曲面的最高點，投射的等高線都呈橢圓形，即都有DPP-ⅠⅤ抑制率的最佳值，說明時間和pH對DPP-ⅠⅤ抑制率交互作用顯著。

2.2.3 響應面模型的驗證 根據Box-Behnken實驗所得數據，利用Design-Expert8.0.5.0軟件處理，可得最佳酶解條件為：酶解時間3.85 h、溫度45.02℃、pH值7.58、酶添加量237.55 U/g（原料），在此條件下預測的DPP-ⅠⅤ抑制率為64.82%。為了檢驗響應面法的可行性，用所得的最佳條件進行驗證性實驗，通過3組平行實驗得到的DPP-ⅠⅤ抑制率為（64.78± 0.24）%，與理論預測值的誤差在±1%以內，說明采用響應面優化得到的酶解工藝參數準確可靠，具有實用價值。

3 結 論

應用響應面法優化動物蛋白水解酶水解南極磷蝦制備DPP-ⅠⅤ抑制肽的工藝參數，在最佳工藝參數條件下獲得的酶解產物抑制率理論值與實測值基本相符，有效的減少了生產操作過程中的盲目性，從而為南極磷蝦DPP-ⅠⅤ抑制肽的高效制備和功能性研究提供了技術參考。

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（責任編輯：任萬森）

Optimization of Enzymatic Preparation Technology Parameters of DPP-ⅠVⅠnhibitory Peptides from Antarctic Krill by Response Surface Method

JⅠ Wei1,ZHANG Chao-hua1,2,3,JⅠ Hong-wu1,2,3
(1.College of Food Science and Technology // 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety // 3.Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Animal protein hydrolase was used to prepare Antarctic krill dipeptidyl peptidase-ⅠⅤ(DPP-ⅠⅤ) inhibitory peptides.With DPP-ⅠⅤ inhibition rate and soluble protein as the main indexes,Antarctic krill enzymolysis parameters such as temperature,pH,enzyme amount and reaction time were investigated.On the basis of single factor experiment data,the quadratic function mathematics model of DPP-ⅠⅤ inhibitory peptides prepared from Antarctic krill with animal proteolytic enzyme was built,according to the Center-Composite Design principles,by four factors of exercise at three levels response surface methodology,with the statistics analysis software based on the DPP-ⅠⅤ inhibition rate as response value.The results showed that the best optimum technology parameters of Antarctic krill enzymolysis were hydrolysis time 3.85 h,temperature 45.02℃,pH 7.58 and enzyme added 237.55 U/g material.Under the above optimum conditions,estimated value of DPP-ⅠⅤ inhibition rate was 64.82%,which was almost in accordance with verified value 64.78%.These results demonstrated the validity of this optimized method.

Antarctic krill；DPP-ⅠⅤ inhibition peptide；animal proteolytic enzyme；technology parameter optimization

TS 201.2；Q556+.3

A

1673-9159（2016）06-0100-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.06.016

2016-05-04

廣東省高等學校學科建設項目（2013CXZDA020）；廣東省產學研項目（2013B090600155）；廣東海洋大學創新強校基金項目(2015)

吉 薇（1989—），女，博士研究生，主要從事生物資源加工與綜合利用研究。E-mail:13536395190@163.com

章超樺，博導，主要從事南海海洋生物資源加工與綜合利用研究。E-mail：zhangch2@139.com