藍莓組織培養污染細菌的分離與鑒定

靳 松，尹利方，夏體淵*，李 冰，徐勝光，任 禛，張永福，牛燕芬，劉一鳴

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

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藍莓組織培養污染細菌的分離與鑒定

靳 松1,2，尹利方1*，夏體淵1**，李 冰3，徐勝光1，任 禛1，張永福1，牛燕芬1，劉一鳴1

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

對污染藍莓組培苗的細菌進行分離和鑒定，為防治藍莓組織培養過程中細菌污染提供科學依據。采用NA培養基分離純化細菌，通過形態特征、生理生化指標結合16S rDNA序列同源性分析，對引起藍莓組培苗污染的細菌進行鑒定。引起藍莓組培苗污染的細菌為菌株LM53和LM85，16S rDNA序列分析結果表明，LM53和B.amyloliquefaciens(HQ727971)、B.vallismortis(FJ386541)、B.licheniformis(EF644414)、B.subtilis(AY583216)聚在同一系統發育分支，同源性為99.9 %～100 %；LM85與蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis(ACNF01000156)聚在同一系統發育分支，同源性為99.7 %。生理生化指標分析表明，LM53與地衣芽孢桿菌相符；LM85與蘇云金芽孢桿菌相符，因此確定引起藍莓組培苗污染的細菌LM85為蘇云金芽孢桿菌，LM53為地衣芽孢桿菌。

藍莓；組織培養；污染；細菌；分離；鑒定

藍莓，又稱越桔或藍漿果，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)植物，多年生落葉或常綠灌木，原產于北美。全世界約400個種，中國約91個種28個變種，分為兔眼藍莓、高叢藍莓、矮叢藍莓3個類別，主要分布于東北和西南地區[1]。藍莓果中含有花色素苷、黃酮等多種多酚類生理活性物成分，聯合國糧農組織將藍莓列為人類五大健康食品之一[2-4]。藍莓的常規繁殖方法較多，有種子育苗、綠枝扦插、硬枝扦插、根插和分株嫁接等[5]，但繁殖系數低，生長速度慢，品種易退化。利用組織培養的方法可以在短期內大大提高繁殖系數，縮短繁殖時間，并且可以保持品種的優良特性，現己成為近年來眾多學者研究的熱點之一[6-8]。

在藍莓組培快繁過程中，雖然在初代培養過程中沒有出現污染，但是在繼代培養1～2代后，接種2～3 d后出現細菌污染，污染率高達10 %以上，一旦被污染，白色菌苔很快布滿培養基表層及外植體的基部，大量消耗營養；外植體停止生長，逐漸枯萎死亡，嚴重影響組培苗的正常生長和繼代。本研究通過NA培養基分離純化細菌，再通過形態特征、生理生化指標結合16S rDNA序列同源性分析，對2株引起藍莓組織培養污染的細菌進行了鑒定，為后期藍莓組織培養污染的預防、無性繁殖技術體系的順利建立提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

污染的藍莓“康維爾(Coville)”組培苗由昆明學院農學院植物組織培養實驗中心提供。

1.2 培養基

細菌分離和培養用NA培養基，液體培養用LB培養基，細菌DNA提取，16S rDNA片段擴增所用的各種酶、Marker、dNTPs、Buffer等試劑為寶生物工程(大連)產品，其余試劑均為國產分析純。

1.3 細菌的分離純化及保藏

挑取污染菌苔接種于NA培養基上進行劃線純化，挑取單菌落于試管斜面中4 ℃保存。

1.4 形態特征觀察及生理生化指標的測定

1.5 16S rDNA序列分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取細菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。PCR反應體系(50 μl)組成：10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[11](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (約50g/L) 1 μl，Taq酶2.5 U，雙蒸水35.5 μl。PCR擴增按Sambrook方法進行[12]。擴增產物經TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定。將測得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)進行同源性搜索[13]，通過MEGA4.0進行比對，隨后選用Maximum Composite Likelihood距離模型進行UPGMA分析生成系統發育樹，發育樹用Bootstrap法(1000次重復)檢驗。用Megalign軟件，將這些序列用Clustal W法進行多序列比對，建立系統發育進化距離圖。

2 結果與分析

2.1 形態特征觀察及生理生化指標的測定

將污染菌苔(圖1a)用平板劃線法進行分離和純化，得到純化菌株2株，即LM85(圖1b)和LM53(圖1c)。菌株LM85(圖1b)在NA培養基上呈乳白色不透明菌落，菌落多為圓形，表面濕潤無光澤，邊緣不整齊，芽孢直桿狀(圖2)，約2 μm。菌株LM53(圖1c)在NA培養基上呈乳白色不透明菌落，菌落圓形，表面濕潤無光澤，邊緣整齊，芽孢直桿狀(圖3)，約2 μm。依據常見細菌鑒定手冊，LM85生理生化指標均與蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis特征相同；LM53生理生化指標均與地衣芽孢桿菌B.licheniformis特征相同(表1)。

a:被污染的藍莓組培苗；b:LM85在NA培養基上的菌落形態；c:LM53在NA培養基上的菌落形態a:Blueberry’s cultivation seedling polluted by the strain LM53 and LM85; b:Colony morphologies of LM85 on NA culture medium; c:Colony morphologies of LM53 on NA culture medium圖1 細菌的形態特征Fig.1 The morphology of strain LM85 and LM53

圖2 LM85的芽孢染色(放大1000×)Fig.2 Spore morphologies of strain LM85 under light microscopy (magnification, 1000×)

圖3 LM53的芽孢染色(放大1000×)Fig.3 Spore morphologies of strain LM53 under light microscopy (magnification, 1000×)

生理生化指標IndexesofphysiologyandbiochemistryLM85LM53細胞直徑>1μm+-芽孢圓形--孢囊膨大--伴孢晶體d-厭氧生長++V-P測定++接觸酶反應++葡萄糖產氣--水解淀粉++耐1%～7%氯化鈉++D-葡萄糖++L-阿拉伯糖-+D-木糖-+D-甘露醇-+形成吲哚--丙酸鹽利用ND+水解酪朊++酪氨酸水解d-硝酸鹽還原++5℃--10d-30++

續表1 Continued table 1

生理生化指標IndexesofphysiologyandbiochemistryLM85LM5340++50-+55-+65--有溶菌酶時生長+dH+2CO2或CO自養生長--

表2 用于構建系統發育樹的菌株相關信息

2.2 16S rDNA序列分析

通過BankIt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)將本研究所得序列LM85和LM53提交到Genbank數據庫中，登錄號分別為KP900946和KP900947。將菌株LM85和LM53的16S rDNA與從GenBank中獲取與該菌株序列同源性較高的部分菌株16S rDNA序列構建系統發育樹(表2)，LM85與蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensis(ACNF01000156)在同一系統發育分支(圖4)，同源性為99.7 %(圖5)。LM53菌株與B.amyloliquefaciens(HQ727971)、B.vallismortis(FJ386541)、B.licheniformis(EF644414)、B.subtilis(AY583216)在同一系統發育分支(圖4)，同源性為99.9 %～100 %(圖5)。LM85的分子鑒定結果與生理生化鑒定結果一致，結合LM53的生理生化鑒定結果(表1)，將LM53鑒定為地衣芽孢桿菌B.licheniformis。

括號中的序號為Genbank登錄號；分支上的數字為自展值百分比；線段0.005為核酸替換率Genbank accession numbers were shown in the parentheses; The number at each branch point was the percentage supported by bootstrap; Bar:0.0005 subsitutions per nucleotide position圖4 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖5 系統發育進化距離Fig.5 Sequence distance of LM85 and LM53 based on 16S rDNA full-length sequence

3 討 論

Leifert14]等研究表明，在初代培養中，表面細菌引起的污染通常在2～3 d就能在外植體周圍的培養基表面形成明顯的水污狀、油污狀、氣泡或干縮的紅、黃、乳白等顏色的菌落；而在外植體培養后3～5 d后才出現的細菌菌落，則可能是由細菌引起的污染。本研究中，藍莓外植體在接種2～3 d后出現細菌污染，推測是由于接種操作過程中，無菌操作不嚴，外植體表面細菌引起的污染。

通過形態特征、芽孢染色和16S rDNA序列同源性分析，表明引起藍莓組培苗污染的細菌是蘇云金芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，屬于革蘭氏陽性菌，由于革蘭氏陽性菌細胞壁的特殊成分，使大多數革蘭氏陽性菌對青霉素敏感，因此，可以篩選出一部分既能抑制細菌生長但對植物的生長不產生影響的抗生素應用于藍莓的組織培養。在組織培養污染防治的研究中，在培養基中加入抗生素或防腐劑的方法已有報道。Reed[15]等在天竺葵(Pelargoniumhortorum)組培中發現頭孢噻肟(Cefotaxime Sodium)的抑菌效果良好，且對芽的增殖有促進作用。韓美麗[16]等在綠巨人(Spathiphyllumkochii)組培中研究了青霉素鈉、先鋒霉素和慶大霉素對繼代培養中細菌污染的抑制效果，結果表明先鋒霉素的抑菌效果最好，青霉素鈉和慶大霉素次之。周蔣陳[17]等在水生鳶尾繼代培養中發現防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉對內生菌污染有抑制作用，其中0.5 %濃度以內的苯甲酸鈉效果最好。

從系統發育樹(圖4)來看，LM85與B.thuringiensis聚在同一系統發育分支，與生理生化鑒定結果一致；LM53與B.subtilis、B.licheniformis、B.vallismortis、B.amyloliquefaciens聚在同一系統發育分支，無法將其鑒定到種，只有結合生理生化指標結果，才能將LM53鑒定為B.licheniformis。由此可見，基于16S rDNA序列分析的系統發育學研究有一定的局限性，16S rDNA序列同源性更適用于屬以上分類單元，對于屬以下分類單元分辨率明顯低。在某些近緣種的鑒定中，如芽孢桿菌屬中解淀粉芽孢桿菌近緣種，很難精確確定它們的分類地位。因此只有有效地將細菌經典分類學和現代分子分類學進行結合，將表型鑒定和分子生物學鑒定綜合分析才能得出更為可靠的結論。

[1]湯偉華. 藍莓莖段初代培養技術[J]. 湖北農業科學, 2012(6):1263-1264 + 1267.

[2]鄭理喬, 黃成林, 劉 華, 等. 兔眼藍莓組織培養過程中褐化與生根問題的探討[J]. 安徽農業大學學報, 2012(5):777-782.

[3]朱宏芬, 沈 嵐, 黃 堅, 等. 兔眼藍莓“燦爛”組織培養與植株再生研究[J]. 北方園藝, 2012, 19:105-107.

[4]呂躍東, 姚 穎, 劉忠玲,等. 不同基質激素對篤斯越桔扦插生根率的影響[J]. 安徽農業科學, 2015(2):53-54.

[5]申 健, 劉德江, 譚 博,等. 木醋在藍莓扦插繁殖與栽培中的應用[J]. 安徽農業科學, 2015(21):77-78.

[6]鄭偉尉, 呂錫山, 慎家輝, 等. 兔眼藍莓“園藍”離體培養增殖技術研究[J]. 中國南方果樹, 2013(1):89-91.

[7]曹增強,徐瑩瑩,張 寧, 等.不同pH對藍莓組培苗生長和元素吸收的影響[J].中國農業大學學報,2016,21(2):50-57.

[8]張 凱,劉明群,趙建華, 等.藍莓品種都克組培苗瓶內生根培養研究[J].中國果樹,2015(1):49-51.

[9]周德慶. 微生物學實驗手冊[M]. 上海:上海科學技術出版社, 1986:65-180.

[10]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社, 2001：349-399.

[11]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆實驗指南[M]. 第2版. 金冬燕, 黎孟楓, 侯云德, 等譯. 北京:科學出版社, 1996:682.

[12]Chun J, Lee J H, Jung Y, et al. EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences[J]. IJSEM, 2007, 57:2259-2261.

[13]Devereux R, Hines M E, Stahl D A. S cycling:characterization of natural communities of sulfate-reducing bacteria by 16S rRNA sequence comparisons[J]. Microb Ecol, 1996, 32(3):283-292.

[14]Leifert C, Ritchie J Y, Waites W M. Contaminants of plant-tissue and cell cultures[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1990, 7(4):452-469.

[15]Reed B M, Mentzer J, Tanprasert P, et al. Internal bacterial contamination of micropropagated hazelnut:identification and antibiotic treatment[J]. Plant Cell, 1998, 52:67-70.

[16]韓美麗, 陸榮生, 黃華艷, 等. 綠巨人組培苗繼代過程中玻璃化苗及細菌污染的消除方法研究[J]. 廣西林業科學研究, 1999, 28(1):16-19.

[17]周蔣陳,邵元健,吳雯雯, 等. 防腐劑對水生鳶尾組培苗內生菌抑制作用的研究[J]. 江蘇農業科學,2009(5):49-50.

(責任編輯 王家銀)

Isolation and Identification of Pollution Bacteria during Tissue Culture of Blueberry

JIN Song1,2, YIN Li-fang1*, XIA Ti-yuan1**, LI Bing3, XU Sheng-guang1,REN Zhen1, ZHANG Yong-fu1, NIU Yan-fen1, LIU Yi-ming1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China; 3.Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Yunnan Kunming 650223, China)

The pollution bacteria during tissue culture of blueberry were isolated and identified so as to provide scientific references for pollution prevention during its tissue culture. Using the NA culture medium to isolate the strains, the bacterial species were identified by morphology, physiological and biochemical and the sequence analysis of the 16S rDNA. The sequences analysis of 16S rDNA indicated that the strain LM53 had the same embranchment with theB.amyloliquefaciens(HQ727971),B.vallismortis(FJ386541),B.licheniformis(EF644414),B.subtilis(AY583216) in the phylogenetic tree with the homology of 99.9 %-100 %. The strain LM85 had the same embranchment with theB.thuringiensis(ACNF01000156) in the phylogenetic tree with the homology of 99.7 %. The results from physiological and biochemical tests showed that the morphological characteristics of the strain LM53 matched the descriptions ofB.licheniformis, the strain LM85 matched the descriptions ofB.thuringiensis. The LM53 strain was identified asB.licheniformisand the LM85 strain was identified asB.thuringiensis.

Blueberry; Tissue culture; Pollution; Bacteria; Isolation; Identification

1001-4829(2016)11-2692-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.033

2015-03-26

云南省都市特色農業工程技術研究中心項目(TSNY0201);昆明學院大學生項目(XJD15055);昆明學院人才引進基金項目(YJL12010);昆明學院校立重點基金項目(XJL12020);云南中煙品牌省內原料產地生態與主栽品種合理布局研究項目;云南省高校優勢特色重點學科(生態學)建設項目資助

靳 松(1984-)，男，云南昆明人，碩士，講師，主要從事園藝植物組織培養的教學及科研工作，E-mail:ibmjs@163.com，*為并列第一作者，**為通訊作者，E-mail:xiatiyuan@sohu.com。

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