尼羅羅非魚不同品系間mtDNA D-loop差異分析

肖 煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，韓 玨，楊 弘

(中國水產科學研究院淡水漁業研究中心/農業部淡水魚類遺傳育種和養殖生物學重點開放實驗室, 江蘇 無錫 214081)

?

尼羅羅非魚不同品系間mtDNA D-loop差異分析

肖 煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，韓 玨，楊 弘*

(中國水產科學研究院淡水漁業研究中心/農業部淡水魚類遺傳育種和養殖生物學重點開放實驗室, 江蘇 無錫 214081)

通過PCR擴增獲得尼羅羅非魚“88品系”(XH)、“99品系”(AN)和吉富品系(GF)3個主要養殖品系共95尾魚的mtDNA D-loop序列，并進行堿基測序及對比分析，探究3個品系在遺傳結構信息、保種現狀和選育潛力的差異。 結果表明:①3個品系個體序列片段長度為550～556 bp，包括111個變異位點，其中轉換、顛換、插入/缺失數依次為65、34、12，多態位點比例為18.64 %。②3個品系共有27個單倍型，XH、AN、GF單倍型數依次為12、7、10，其中GF、AN共享1個單倍型，XH、GF共享1個單倍型，其他為各品系獨有。3個品系的單倍型在NJ系統樹上互相交叉，GF有2個單倍型在變異水平上形成獨有的進化枝。③3個品系間遺傳分化指數均大于0.05，存在中等程度的遺傳分化，其中XH與AN、XH與GF之間遺傳漂變起主要作用，AN與GF之間基因流起主要作用。研究結果表明，目前選育的3個尼羅羅非魚品系內遺傳多樣性水平較高；品系間存在中等程度的遺傳分化，并具備高比例的獨有單倍型， 3個品系目前仍具備較高的選育潛力。

尼羅羅非魚；養殖品系；遺傳結構；mtDNA D-loop；遺傳分化

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)隸屬于鱸形目(Perciformes)、麗魚科(Cichlidae)羅非魚屬(Oreochromis)，是聯合國糧農組織向全世界推廣養殖的優質魚類。20世紀80年代以來，我國數次引進尼羅羅非魚原種群體，經過多代選育改良，形成數個性狀優良的養殖品系，作為羅非魚主要養殖品系在我國南方主產區得到推廣，推動了我國羅非魚種業穩步、快速的發展。羅非魚不同品系群體間因為原種地生境隔離、人工選育方式差異等因素在生長特性和抗逆性方面也存在較大差異，同時在長期的選育過程中因為種間雜交、選育強度等因素易發生種質退化等現象[1]，因此了解目前羅非魚主要養殖品系的種質情況對羅非魚的保種選育及遺傳多樣性保護具有非常重要的意義。mtDNA D-loop是線粒體DNA中的一段非編碼區，具有分子量小、結構簡單、進化速度快、高度多態、母性遺傳等特點，被廣泛應用種群的進化研究和遺傳多樣性分析[2]。Beheregaray等[3]利用mtDNA D-loop結構分析了海洋與湖泊中的銀漢魚群(Odontesthesargentinensis)的遺傳結構，發現兩者有共同的祖先，因為生境變遷導致群體間出現明顯的遺傳分化；Ryota等[4]對利用mtDNA D-loop序列變異解析了日本北海道和本州的杜父魚群(Cottusnozawae)的遺傳結構，并探尋導致魚群遺傳分化的地理因素；Nakadate等[5]利用mtDNA D-loop序列分析對藍鰭金槍魚(Thunnusorientalis)開展個體繁殖力比較研究，尋找繁殖能力強的優異雌魚；劉紅艷等[6]對3個海南、福建、廣東 3 地的野生黃鰭鯛(Sparuslatus)種群開展mtDNA D-loop序列分析對比，對 3 地種群親緣關系進行了比較；張玉波等[7]利用mtDNA D-loop序列對東方鲀屬11種魚類開展系統發育遺傳分析，并由此推測東方鲀屬魚類起源于印澳熱帶海域(東印度洋和西太平洋海域)。上述研究針對同一種魚不同地理種群或養殖群體，利用傳統的標記分析常常很難發現差異，而線粒體D-loop區豐富的變異可作為種群鑒定的一個很好的工具。本研究采用PCR、克隆結合DNA測序技術對目前國內尼羅羅非魚3個主要養殖品系開展mtDNA D-loop分析，以期根據它們的基因片段多態性來揭示尼羅羅非魚不同品系養殖群體的遺傳多樣性，了解尼羅羅非魚的種質現狀，為尼羅羅非魚的保種選育工作提供參考建議。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別采自淡水漁業研究中心保種的“88品系”尼羅羅非魚(簡稱XH)30尾，“99品系”尼羅羅非魚(簡稱AN)30尾，吉富羅非魚(簡稱GF)35尾。湘湖品系尼羅羅非魚、埃及品系尼羅羅非魚的選育是采用群體選育法，而吉富羅非魚是采用家系選育法進行的選育。

1.2 實驗試劑及儀器設備

PCR反應所用的Taq-DNA聚合酶、dNTPs、250 bp-ladder Marker等試劑均購于TaKaRa生物公司。電泳儀為BIO-BAD PowerPac Universal；PCR儀為Eppondorf Mastercycler Gradient；成像儀為Gene Company Limited G-box型凝膠成像系統。

1.3 基因組DNA的制備和檢測

尾靜脈取全血(ACD抗凝)，50 μl血液加裂解液(0.5 %十二烷基肌氨酸鈉、0.02 %蛋白酶K、10 mmol/L EDTA) 200 μl，50 ℃溫育2 h (其間不時搖動混勻)，酚-氯仿法抽提DNA，無水乙醇-20 ℃過夜沉淀1次，70 %酒精洗滌1次，干燥后加0.1×TE 50 μl溶解DNA，50倍稀釋后即為模板用于PCR擴增0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，稀釋至100 ng/μl，4 ℃保存備用。

1.4 mtDNA D-loop區的PCR擴增

本實驗擬擴增并測定羅非魚mtDNA D-loop區的序列，參考吳長敬等[8]選擇了用于擴增尼羅羅非魚mtDNA D-loop序列的1對引物344F與PHE1R，引物由上?；瞪锛夹g有限公司合成。引物序列為344F:5′-CTATTACTGGCATCTGGTTCC-3′和PHE1R:5′-ACATCTTCAGTGTTACGCTT-3′進行PCR擴增。

1.5 PCR產物檢測與目的片段的測序

PCR擴增反應產物用0.8 %瓊脂糖膠電泳，5 V/cm電泳0.5 h左右，G-Box記錄電泳結果，將確定為目的片段的PCR擴增產物送上?；瞪锛夹g有限公司進行正反向測序。

1.6 數據分析

先對正、反向序列進行重疊區拼接，除去多余的堿基片段(Contig-Express軟件)。再對序列進行編輯校正(BioEdit軟件)；之后進行BLAST分析(GenBank)，確認PCR得到的序列是羅非魚mtDNA D-loop區部分序列。對編輯校正后的序列進行比對分析(ClustalX2軟件)。分析序列特征，統計序列的堿基組成和變異情況，用Kimura2-parameter模型計算遺傳距離，并構建NJ系統發育樹(MEGA5軟件)。統計品系的遺傳多樣性參數H單倍型多樣度、K平均核酸差異數、Pi核苷酸多態性、Fst遺傳分化指數以及品系間的基因流Nm值(DnaSPv5軟件)。

2 結果與分析

2.1 羅非魚mtDNA D-loop區部分序列結構特征

mtDNA D-loop序列片段在對比除去引物序列后，堿基序列長度為550～556 bp，部分序列出現堿基插入/缺失現象，導致序列出現長度的多態性。序列堿基組成見表1，3個品系的堿基組成基本一致，無顯著差異。A、G、T、C 4個堿基的平均含量分別

表1 尼羅羅非魚3個品系mtDNA D-loop序列堿基組成

為29.1 %、15.6 %、35.0 %、20. 2 %，可見其中堿基T的含量最高，堿基G的含量最低。A+T(平均為64.1 %)的含量明顯高于G+C(平均為35.9 %)的含量。

2.2 羅非魚不同品系的遺傳結構分析

通過Mega 5軟件統計控制區序列變異位點在不同選育品系中的分布，結果見表2。其中，3個品系的轉換數>顛換數>插入/缺失數，總體轉換/顛換比率為1.91。95尾羅非魚共檢測出27個單倍型，其中GF、AN共享1個單倍型(GF02與AN01相同)，XH、GF共享1個單倍型(XH03與GF08相同)，其他單倍型分別為各群體獨有。

表2 尼羅羅非魚3個品系mtDNA D-loop區序列變異

XH01～13:XH的13種單倍型；GF01～10:GF的10種單倍型；AN01～07:AN的7種單倍型；點(.)表示與第1條序列相同，短橫線(-)表示插入或缺失XH01-13:the thirteen haplotypes of XH；GF01-10:the ten haplotypes of GF；AN01-07:the seven haplotypes of AN; Identity with the first sequence is denoted by dots(·) and insertion/deletion position is denoted by short horizontal lines(-)圖1 尼羅羅非魚3個品系mtDNA D-loop區部分序列變異Fig.1 Variations of partial sequence of D-loop region in three strains of tilapia

以27個單倍型的D-loop序列構建的NJ系統樹及其在3個選育品系中的分布如圖2所示。單倍型在3個養殖品系中的分布可以看出，各品系都已形成自己特有的單倍型類群，其中XH品系中XH02單倍型出現頻率最高，包括9個個體；GF品系中GF05單倍型出現頻率最高，包括12個個體；AN品系中AN01單倍型出現頻率最高，包括18個個體。3個品系中AN01(GF02)單倍型出現頻率最高，共23個。由拓撲結構可以看出，27種單倍型形成3大分支，3個選育品系的單倍型在NJ系統樹上互相交叉，其中GF品系出現的單倍型(GF01、GF09)形成單獨的一個進化枝，尼羅羅非魚3個養殖品系在控制區序列變異水平上有各自的特點。

圖2 27個單倍型的NJ系統樹及其在尼羅羅非魚各品系中的分布Fig.2 NJ phylogenetic tree of twenty-seven haplotypes and its distribution in different strains of tilapia

品系Strains單倍型多樣度H平均核苷酸差異數K核苷酸多態性PiXH0.87120.130.0375GF0.83420.730.0380AN0.62821.800.0399

表4 3個品系間的基因交流Nm值(左下)和遺傳分化Fst值(右上)

表5 3個品系間遺傳距離(下三角)和標準差(上三角)

2.3 品系群體遺傳多樣性參數的統計

單倍型多樣度大小依次排列為GF>XH>AN；平均核酸差異數大小依次為AN>GF>XH；核苷酸多態性(Pi)是衡量一個品系養殖群體mtDNA遺傳多樣性的重要指標，其大小排列依次為AN>GF>XH，其中AN品系多樣性最高為0.399。

2.4 品系間遺傳分化及遺傳距離

從品系間遺傳分化指數Fst和基因流Nm的角度對品系間的遺傳分化進行分析(表4)，3個品系群體之間的遺傳分化指數均大于0.05，已經產生了中等程度的遺傳分化。GF和AN之間Nm>1，基因流在遺傳分化中起了主要作用；XH與AN、GF之間Nm<1，遺傳漂變在遺傳分化起重要作用。

用Kimura 2-parameter 模型計算基于控制區部分序列差異的3個品系群體間遺傳距離的D值(表5)。群體間的堿基序列的差異反映的是親緣關系的遠近。由表5可知，群體間的遺傳距離以 XH與GF之間的值相對較大(0.070)，而GF與AN遺傳距離較近(0.047)，XH與GF、AN之間的遺傳距離顯著大于GF與AN之間的遺傳距離。

3 討論與結論

人工選育過程中，經常出現不確定因素，如近交機率增加、有效群體容量不斷減少等，有可能導致遺傳多樣性降低，從而降低遺傳效應[9-10]，同時選育過程中群體純度的提高又可以將優良經濟性狀穩定遺傳到下一代中，具備極高的經濟價值，因此了解不同品系的尼羅羅非魚的遺傳信息結構對于尼羅羅非魚的種質改良和選育潛力挖掘等方面具有重要意義。本實驗所測定的3個品系養殖群體的mtDNA D-loop區序列中，A、G、T、C 4個堿基的平均含量分別為29.1 %、15.6 %、35. 0 %、20. 2 %，由各堿基的含量可以看出，控制區序列的堿基組成呈現出很強的偏向性，在4 種堿基中，G的含量最低，T的含量最高；此外，尼羅羅非魚控制區中A+T的含量(64.1 %)明顯高于G+C的含量(35.9 %)，與脊椎動物線粒體DNA序列的堿基組成特點相符合[11]。在3個品系共檢測到111個變異位點，其中轉換65個，顛換34個，有12個插入/缺失位點，可見堿基的轉換數明顯大于顛換數，符合動物線粒體DNA堿基變異的特點，轉換在近親種間比較容易頻繁的發生，顛換則在較遠源種間逐漸顯現。

Pi核苷酸多態性是分子遺傳學中評價遺傳多樣性的靈敏指標，可用來衡量不同養殖品系的遺傳多樣性的高低。本研究中，3個選育群體的Pi值分別為0.0375、0.0380、0.0399，相比太湖鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)的平均Pi值為0.0124[12]，養殖刀鱭(Coilianasus)的平均Pi值為0.0099[13]，黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的平均Pi值為0.0061[14]，本研究中的尼羅羅非魚各品系養殖群體間mtDNA D-loop區多態性比較豐富。95個樣本共檢測出27個單倍型，在NJ系統樹中27種單倍型形成了3大分支，推斷這些單倍型可能來源于3個不同母系祖先。尼羅羅非魚原產于非洲，其中XH、AN 2個品系是20世紀80～90年代我國從非洲尼羅河不同流域引進的原始群體，并在國內通過多代群體選育；而GF品系是由FAO通過對4個非洲原產地直接引進的尼羅羅非魚品系(埃及、加納、肯尼亞、塞內加爾)和4個在亞洲廣泛養殖的尼羅羅非魚品系(以色列、新加坡、泰國、中國臺灣)進行家系選育而成[15]。尼羅河羅非魚分布在尼羅河周邊了維多利亞湖、艾伯特湖等多個水系，由于一定的地理因素使得不同生境的尼羅羅非魚可能具有不同遺傳背景的母系來源[16-17]，而吉富羅非魚又是多個品系雜交而成，母本來源更加復雜，單倍型結果分析也較好地印證了以上因素。

由單倍型在3個品系養殖群體中的分布可以看出，GF品系與AN、XH品系分別共享1個單倍型，其他25個單倍型均為3個品系獨有。NJ系統樹上3個品系的單倍型在互相交叉，但同時GF品系中GF01、GF09單倍型形成獨有的進化枝，說明GF品系在控制區序列變異水平上具備獨特的遺傳結構。從群體遺傳分化指數Fst對品系間的遺傳分化進行分析，Wright[18]認為，遺傳分化指數Fst<0.05表示群體間無遺傳分化發生，3個選育品系之間的遺傳分化指數均大于0.05，說明它們之間已經產生了中等程度的遺傳分化。而理論上Nm< 1時，遺傳漂變是群體間遺傳分化的主要因素；Nm> 1，基因流為主要作用[19]。XH與GF、AN之間基因流均小于1，遺傳漂變在遺傳分化中起了主要作用；而GF與AN之間基因流大于1，在遺傳分化中起了主要作用，阻止了由遺傳漂變引起的遺傳分化。同時在遺傳距離方面還是Fst方面，XH品系與AN、GF品系間遺傳距離大于AN與GF之間的遺傳距離，說明相比XH品系AN與GF親緣關系較近。遺傳結構研究表明3個選育品系目前仍具備較高的選育潛力，研究結果為后續的尼羅羅非魚的種質改良和選育潛力挖掘積累了遺傳背景信息，為羅非魚選育工作提供了理論依據。

[1]肖 煒, 楊 弘, 李大宇, 等. 同種羅非魚(Tilapia)不同地區選育群體的遺傳多樣性分析[J]. 海洋與湖沼, 2010, 41(4):530-537.

[2]Rosel P E, Haygood M G, Perrin W F. Phylogenetic relationships among the true porpoises (CetaceaPhocoenidae)[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1995, 4(4):463-474.

[3]Beheregaray L B, Sunnucks P. Fine-scale genetic structure, estuarine colonization and incipient speciation in the marine silverside fishOdontesthesargentinensis[J]. Molecular Ecology, 2001, 10(12):2849-2866.

[4]Ryota Y, Akira G. Phylogeography of a freshwater sculpin,Cottusnozawae, from the northeastern part of Honshu Island, Japan [J]. Ichthological Research, 2002, 49(2):147-155.

[5]Nakadate M, Kusano T, Fushimi H, et al. Multiple spawning of captive Pacific bluefin tuna(Thunnusorientalis) as revealed by mitochondrial DNA analysis[J]. Aquaculture, 2011, 310(3):325-328.

[6]劉紅艷, 江世貴, 蘇天鳳, 等. 3個水域黃鰭鯛線粒體 DNA D-loop 基因序列多態性研究[J]. 水產學報, 2004, 28(4):371-374.

[7]張玉波, 甘小妮, 何舜平. 線粒體D-loop序列變異與東方鲀屬魚類系統發育[J]. 水生生物學報, 2009, 33(4):656-663.

[8]吳長敬, 鄒芝英, 楊 弘, 等. 羅非魚mtDNA D-loop區部分序列結構和種群遺傳多樣性分析[J]. 動物學雜志, 2010, 45(5):121-128.

[9]Wolfus G M, Garcia D K, Alcivar-Warren A. Application of the microsatellite technique for analyzing genetic diversity in shrimp breeding programs[J]. Aquaculture, 1997,152:35-47.

[10]頡曉勇, 李思發, 蔡完其.吉富品系尼羅羅非魚選育過程中遺傳變異的微衛星分析[J]. 水產學報, 2007, 31(3):385-390.

[11]Broughton R E, Milam J E, Roe B A, et al. The complete sequence of the zebrafish (Daniorerio) mitochondrial genome and evolutionary patterns in vertebrate mitochondrial DNA[J]. Genome Research, 2001, 11(11):1958-1967.

[12]王茂元, 楊 弘, 鄒芝英, 等. 太湖鰱魚mtDNA D-loop區遺傳多樣性[J]. 中國農學通報, 2009, 25(13):263-267.

[13]徐鋼春, 魏廣蓮, 李建林, 等. 基于線粒體 DNA D-loop 序列分析養殖刀鱭與湖鱭的遺傳多樣性[J]. 大連海洋大學學報, 2012, 27(5):448-452.

[14]劉朋朋, 鐘立強, 潘建林, 等. 基于線粒體D-loop區分析黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)五個淡水湖泊群體的遺傳多樣性[J]. 海洋與湖沼, 2013, 44(3):728-733.

[15]何 杰, 徐 跑, 董在杰, 等. 吉富品系尼羅羅非魚(GIFT)群體內的形態差異與分化[J]. 中國水產科學, 2009, 16(1):54-60.

[16]Hassanien H A, Gilbey J. Genetic diversity and differentiation of Nile tilapia (Oreochromisniloticus) revealed by DNA microsatellites[J]. Aquaculture Research, 2005, 36(14):1450-1457.

[17]Bezault E, Balaresque P, Toguyeni A, et al. Spatial and temporal variation in population genetic structure of wild Nile tilapia (Oreochromisniloticus) across Africa[J]. BMC Genet, 2011, 12(1):102.

[18]Wright S. Evolution and the genetics of populations[M]. Chicago:University of Chicago Press, 1978:1-30.

[19]Slatkin M. Gene flow and the geographic structure of natural populations[J]. Science, 1987, 236:787-792.

(責任編輯 陳 虹)

Genetic Variation of Mitochondrial DNA D-loop Sequences from Different Strains of Nile tilapia,Oreochromisniloticus

XIAO Wei, LI Da-yu, ZOU Zhi-ying, ZHU Jing-lin, HAN Jue, YANG Hong*

(Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Jiangsu Wuxi 214081, China)

The mitochondrial DNA D-loop sequences of ninety-five individuals from three dominated tilapia culture strains [Nile tilapia ‘88 strain’(XH), ‘99 strain’(AN) and GIFT strain(GF)]were studied to understand the differences of the genetic structure, breeding effect and genetic potential of the three strain populations. The results showed that:(i)The length of their region sequences from three populations was 550-556 bp, including 111 variable sites, of which the transition, transversion and insert/deletion sites number were 65, 34 and 12, respectively, polymorphic loci occupying 18.64 % in total sites.(ii)There were 27 haplotypes in three strain populations, which was 12 for XH strain, 7 for AN strain and 10 for GF strain, respectively, of which GF and AN shared a haplotype, XH and GF shared another haplotype, and others were exclusive to each strain. The haplotypes of three strains crossed each other in the NJ tree but two special haplotypes of GF formed a unique clade. (iii)TheFstvalues among three strain populations were all more than 0.05, which indicated that the genetic differentiation among them was moderate, of which the genetic drift played a major role between XH and AN, XH and GF, otherwise the gene flow played a main role between AN and GF. It was concluded that there was a high level of genetic diversity in three Nile tilapia strain populations, and there were moderate genetic differentiation and a high proportion of unique haplotypes among three strain populations, which indicated that the three tilapia strains still had a full potentiality in breeding selection.

Nile tilapia; Aquaculture strains; Genetic structure; Mitochondrial DNA D-loop; Genetic differentiation

1001-4829(2016)11-2752-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.044

2015-11-14

現代農業產業技術體系專項資金(CARS-49)；中央級公益性科研院所基本科研業務費(2015JBFM18)；現代農業人才支撐計劃(2130106)

肖 煒(1982-)，男，江蘇宜興人，助理研究員，主要從事羅非魚遺傳育種研究，E-mail xiaow@ffrc.cn，*為通訊作者，E-mail yangh@ffrc.cn。

S917.4

A