利用間歇浸沒式生物反應器進行慈姑組培快繁研究

高美萍，林志城，張 馳，江 文，何芳練，楊 柳，韋紹龍*

(1.廣西農業科學院生物技術研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西植物組培苗有限公司，廣西 南寧 530007；3.廣西桂林市平樂縣農業局，廣西 平樂 542400)

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利用間歇浸沒式生物反應器進行慈姑組培快繁研究

高美萍1，林志城2，張 馳3，江 文1，何芳練1，楊 柳1，韋紹龍1*

(1.廣西農業科學院生物技術研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西植物組培苗有限公司，廣西 南寧 530007；3.廣西桂林市平樂縣農業局，廣西 平樂 542400)

以慈姑(Sagittariasagittifolia)莖尖誘導的組培苗為材料，利用間歇浸沒式生物反應器(TIBs)開展慈姑組培快繁激素組合的篩選、慈姑不同代數繼代材料的培養效果、不同接種密度對慈姑組培增殖影響及不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響等組培快繁技術體系研究。結果表明：TIBs系統可以使慈姑組培苗一代增殖19.5倍以上，比傳統方法提高3倍以上；培養基含6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.01 mg/L的TIBs適合組培苗繼代增殖培育；TIBs系統中，以第5代繼代材料為宜，接種密度10株/L，間歇浸沒頻率在10 min/3 h時，最有利于慈姑組培苗的增殖和生長。

慈姑；組培快繁；間歇浸沒式生物反應器(TIBs)

慈姑(SagittariasagittifoliaL.)是澤瀉科(Alismataceae)慈姑屬宿根性水生草本。在我國主要分布于長江流域及其以南各省(區)，其中太湖沿岸及珠江三角洲為主產區，長江以北亦有少量栽培。廣西是全國優良慈姑品種白慈姑主產區，已有一、兩百年栽培歷史，其中“桂林白慈姑”以球莖個大、皮白、品質優、無苦澀味，商品性好而聞名國內外。

目前我國慈姑種植方式主要為留種繁殖，以球莖留種過程不僅消耗大量商品慈姑，而且還占用大量田地，同時，因慈姑主產區多年連作，導致病蟲害逐年加重，許多優良品種種性退化、產量下降等諸多問題。采用慈姑組培苗繁殖，可保持品種優良種性，節約用種成本，朱紅蓮等[1-2]對慈姑組織培養研究結果表明，慈姑組織培養繼代一代僅增殖3～4倍，且慈姑組培苗內生菌污染特別嚴重，繼代培養2～3次仍可再次出現內生菌污染，影響慈姑的快速繁殖的進展[3]；間歇浸沒式生物反應器(TIBs)是一種用于植物組織培養和植物次生代謝物研究的系統，其原理是利用液體培養基以經過過濾的空氣壓力為動力對植物組培苗進行間歇式培養，使材料獲得最大的增殖數。該系統自動化程度高，在2個月的培養周期中，材料無需轉接，節省人力物力，在組織培養過程中可大為降低生產成本[4-7]。目前有關“桂林白慈姑”組培苗快繁相關技術研究尚未見報道，因此，擬通過采用TIBs系統對慈姑進行組培快繁研究，為慈姑組培苗生產提供理論依據和技術支撐，對解決市場需求及實現慈姑組培苗工廠化生產及對推動慈姑產業的可持續發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西農業科學院生物技術研究所提供的經莖尖脫毒培養的慈姑組培苗“桂慈1號”。TIBs系統參照Lorenzo等[8]設計思路建立。TIBs 系統中培養瓶和儲液瓶分別為 2.5和3.0 L 的廣口白色玻璃瓶和三角瓶，瓶高分別為26和30 cm，直徑為14和15 cm。儲液瓶中液體培養基體積均為1.0 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 TIBs系統與傳統慈姑組培方法的比較 傳統慈姑組培采用半固體培養方式，培養基采用MS+6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+白糖25 g/L。TIBs系統各參數參考Lorenzo等[8-9]的設計思路，接種密度為10株/L，間歇頻率按浸沒10 min 間歇1 h。TIBs系統繼代增殖培養6周。傳統方法每3 周繼代1次，比較兩種方法的增殖倍數、萌芽時間、株高、葉片數、生根數。

1.2.2 TIBs系統中慈姑組培快繁激素組合的篩選 試驗以第6代繼代組培苗，接種密度為10株/L，TIBs系統間歇頻率按浸沒10 min 間歇1 h，6-BA質量濃度為1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/L ，NAA質量濃度為0.01、0.05 mg/L。

1.2.3 慈姑不同代數的繼代材料在TIBs系統中的培養效果 利用繼代數為1～8 代的組培苗為材料，增殖培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 0.01 mg/L+白糖25 g/L，TIBs系統間歇頻率按浸沒10 min 間歇1 h，接種密度10株/L。

1.2.4 不同接種密度對TIBs系統中慈姑組培增殖影響 試驗材料為經5次繼代的組培苗，增殖培養基及TIBs系統設計同試驗方法1.2.3，接種密度為5、10、15、20和25株/L。

1.2.5 TIBs系統中不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響 試驗材料為經5次繼代的組培苗，增殖培養基同試驗方法1.2.3，接種密度為10株/L，TIBs系統浸沒間歇頻率按浸沒10 min 分別間歇1、3、6、12和24 h。

以上各試驗培養條件：光照強度1500 lx，培養溫度(28±2) ℃，光照16 h/d，黑暗8 h/d。培養基pH 5.0～6.0，增殖培養6周。試驗均設每個處理5套TIBs系統，重復3次，采集增殖倍數、株高、萌芽時間、生根數、污染率等，取平均值。試驗數據采用SPSS18.0軟件SNK法進行統計及多重比較顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 TIBs系統與傳統慈姑組培方法比較

由表1可見，慈姑組培苗1代繼代增殖倍數在傳統Semi-solid培養方式下為6.3倍，而利用TIBs系統培養，其增殖倍數為19.5倍，兩者差異達顯著水平(P<0.05，下同)。TIBs系統培養方式下，組培苗的株高、生根數和葉片數等指標均高于傳統方法，其中株高、生根數顯著高于傳統方法，而兩種方法下慈姑組培苗葉片數差異不顯著(P>0.05，下同)。

2.2 TIBs系統中慈姑組培快繁激素組合的篩選

從表2可以看出， 當NAA添加濃度固定時，慈姑組培苗的增殖倍數均隨著6-BA添加濃度增加而增加。當NAA添加濃度為 0.05 mg/L時，6-BA添加濃度為4.0 mg/L處理的組培苗增殖倍數(22.7)顯著高于其他處理，1.0 mg/L處理組培苗增殖倍數(10.5)顯著低于其他處理， 2.0 和3.0 mg/L2處理之間增殖倍數差異不顯著，且均顯著高于1.5 mg/L處理。當NAA添加濃度為0.01 mg/L時，6-BA添加濃度為4.0 mg/L處理的組培苗增殖倍數(25.3)顯著高于其他處理，1.0 mg/L處理組培苗增殖倍數(12.6)顯著低于其他處理， 1.5和2.0 mg/L 2處理之間增殖倍數差異不顯著，且均顯著低于3.0 mg/L處理。當NAA添加濃度固定時，不同6-BA添加濃度處理間，慈姑組培苗株高、葉片數和生根數差異均不顯著；NAA添加濃度為0.05 mg/L處理慈姑組培苗生根數均顯著多于0.01 mg/L處理。同時，在研究過程中觀察發現，當6-BA濃度達 4.0 mg/L 時，雖然增殖倍數多，但其植株較細，長勢稍遜，且出現一部分玻璃化苗，這可能與6-BA濃度高有關。為降低組培苗變異率，保證組培苗質量，又不影響增殖倍數，選擇6-BA 3.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L效果較好。

表1 TIBs系統與傳統慈姑組培方法比較

注：同列數據后*表示差異達顯著水平(P<0.05)。

Note:* in the same column meant significant difference(P<0.05).

表2 TIBs系統中慈姑組培快繁激素組合的篩選

注：同列數據后不同小字母表示差異達5 %顯著水平。下同。

Note:Different capital and small alphabets in the same column meant significant difference at 5 %.

2.3 慈姑不同代數的繼代材料在TIBs系統中的培養效果

從表3可知，在第3代以前的材料增殖倍數為7倍左右，從第4代開始顯著增加，其中第5代材料增殖倍數為19.5，顯著高于前4代材料，且與第6～8代材料差異不顯著。在TIBs系統中，為保證慈姑組培苗有足夠材料又不影響增殖條件下，選擇第5代苗為繼代材料進行快繁較好。在1～5代，隨著代數的增高，萌芽的時間呈縮短趨勢，但差異不顯著，均為3 d左右，在第6～8代，萌芽時間推遲，為5 d左右；不同繼代材料對葉片數、株高影響不顯著。前6代污染率均為0，第7和8代污染率分別為15.00 %和17.00 %。

2.4 不同接種密度對TIBs系統中慈姑組培增殖影響

從表4結果可以看出，在TIBs系統中，慈姑組培苗增殖倍數隨接種密度增加呈先增大后減少的趨勢；其中接種密度為15株/L處理，增殖倍數最大(20.9倍)，顯著高于除10株/L處理外的其他各接種密度處理，接種密度為10、20和25株/L處理間增殖倍數差異均不顯著，且均顯著高于5株/L處理。慈姑組培苗萌芽時間隨接種密度增加呈縮短趨勢，其中25株/瓶處理萌芽用時最少，為2.6 d，顯著少于其他處理；5株/L處理萌芽用時最長，為6.2 d，顯著高于其他處理；10～20株/L處理間萌芽時間差異不顯著，均為4.0 d左右。不同接種密度對慈姑組培苗株高、葉片數的影響差異均不顯著。培養基污染率隨接種密度增加而增加，其中接種密度為5和10株/L的處理污染率均為0。因此，從不影響繼代增殖倍數及植株生長，又可降低培養基被污染風險角度綜合考慮，選擇10株/L的接種密度為宜。

表3 不同代數繼代組培苗在TIBs系統中的增殖效果

表4 不同接種密度對TIBs系統中慈姑組培增殖影響

表5 TIBs系統中不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響

2.5 TIBs系統中不同間歇頻率對慈姑組培快繁的影響

在TIBs 系統中，隨著間歇頻率的降低，繼代增殖倍數降低。如表5所示，間歇頻率為10 min/h和10 min/3h處理之間的增殖倍數差異不顯著，且均顯著高于其余各處理；不同間歇頻率處理對萌芽時間影響差異不顯著，均在3 d左右；組培苗的株高和根長均隨間歇頻率降低呈增加趨勢，且各處理間差異均達顯著水平。隨著間歇頻率的降低，組培苗污染率的風險提高，24 h時，污染率達到20.00 %。綜合繼代增殖率、同時又能控制低污染率，節約電能等考慮，最優選擇間歇頻率為10 min/3h。

3 討 論

TIBs系統培養綜合固體培養和液體培養的有點，并對其進行了優化，使培養材料達到最大的增殖數。Angela[10]等將澳大利亞的幾個不同甘蔗品種在不同生物反應器進行試驗比較，發現利用 TIBs 系統的甘蔗組培苗一代增殖率超過20倍。本研究條件下，慈姑組培苗在TIBS系統中繼代增殖達19倍以上，遠遠高于傳統方法。在國內，劉麗敏等[14]利用該系統對ROC16和ROC22兩個甘蔗品種研究，發現ROC16一代增殖率達40倍， ROC22一代增殖率為30倍。目前國內外利用此套系統研究的作物種類也在不斷增加，報道較多的主要有菠蘿[11]、香蕉[12-13]、甘蔗[14-15]、桉樹[16]、咖啡[17]等。

在利用TIBs進行組培快繁的過程中，不同代數對組培苗的繼代增殖效果不同。使用不同代數的繼代苗為材料，其組培苗的生長、增殖等狀況也不同。Quiala等[18]在利用TIBS進行菠蘿組培快繁時研究發現，以第2代繼代苗為外植體時，保持了較高的增殖和生長能力，而粟靖等[19]研究發現，以第7代香蕉繼代組培苗為材料時，香蕉的生長和增殖達到最好效果。本研究結果表明在控制組培苗變異率情況下，慈姑工廠化生產的代數一般不高于8代效果最好。

接種密度是TIBs系統中重要的調控參數之一。McClelland等[20]報道，外植體數/培養基量、外植體數/容器容積等比值直接影響器官形成與發育，培養過程中適宜的接種密度隨植物種類不同而有所差異。篤斯越橘叢生苗(Vacciniumuliginosum)也具有類似特性[21]。楊柳等[13]研究報道，在TIBs系統中接種密度在10～15株/L時組培苗增殖和生長較優。Angela[10]等發現在TIBs系統中接種密度在15～20株/L時效果最好。而本研究結果則表明較低的接種密度(10株/L)既能控制低污染率又不影響組培苗增殖效果。

間歇浸沒頻率影響植物組培快繁，不同作物對間歇頻率要求不同。Marta 等[22]得出的結論是短的浸沒時間和高頻率浸沒能增加栓皮櫟體細胞胚的數量和質量(1 min浸沒間歇12 h)，相反，Raúl等[23]對酒店草研究結果顯示，低頻率浸泡(每24 h)和短浸泡時間(5 min)比每3和12 h組培增殖產生更好的結果。本實驗研究發現，提高間歇浸沒頻率，有利于降低內生菌污染風險。這可能與高頻率的氣體交換，及間干間濕的生長環境有關，具體原因有待進一步深入分析。

4 小 結

本研究結果表明，利用TIBs系統進行慈姑組培苗快繁，適宜增殖生長的培養基激素組合為6-BA 3.0 mg/L +NAA 0.01 mg/L，取第5代繼代材料，接種密度10株/L，間歇浸沒時間10 min/3h，繼代增殖倍數達19倍以上。該實驗為利用間歇浸沒式生物器進行慈姑組培快繁的研究應用，為實現大規模、自動化慈姑組培健康種苗的工廠化生產奠定一定基礎，為推廣TIBS系統在植物組培中的應用提供了實驗依據。

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(責任編輯 汪羽寧)

Optimization ofSagittariasagittifoliaRapid Propagation in Temporary Immersion Bioreactors System

GAO Mei-ping1，LIN Zhi-cheng2，ZHANG Chi3, JIANG Wen1，HE Fang-lian1，YANG Liu1，WEI Shao-long1*

(1.Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007,China；2.Guangxi Plant Tissue Cultured Seedlings Co. Ltd,Guangxi Nanning 530007,China;3.Guangxi Pingle Agricultural Bureau,Guangxi Pingle 542400,China)

A new protocol using temporary immersion bioreactors (TIBs) was established for micro-propagation ofSagittariasagittifolia. The influence of different hormone , sub-cultured , immersion frequency together with inoculation density onSagittariasagittifoliamultiplication in TIBs was carried out in this paper. The resulted showed that more than 19.5 times multiplication rate were obtained in TIBs, which was more than three times higher than that of traditional method. And also better morphological characteristics were obtained in TIBs. TIBs with 3.0 mg/L 6-BA+NAA 0.01 mg/L were good forSagittariasagittifoliaproliferation and growth. In TIBs , the materials from 5thsubcultures resulted in a higher multiplication rate than other subcultures. And the most suitable density inoculums were 10 plantlets per liter. Temporary frequency of 10 min per 3 h was suitable for multiplication. This research provided the theory basis forSagittariasagittifoliafactory production.

Sagittariasagittifolia; Rapid propagation; Temporary immersion bioreactors (TIBs)

1001-4829(2016)11-2704-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.11.035

2016-07-11

廣西農業科學院科技發展基金項目(2015JM10)；廣西農業廳和農科院共建項目(廣西平樂慈姑試驗站)

高美萍(1985-)，福建南平人，助理研究員，主要從事生物技術育種與植物組培快繁技術研究工作, *為通訊作者，E-mail：weishaolong@gxass.net。

S645.9

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