Netrin-1通過下調氧糖剝奪誘導的人神經母細胞瘤自噬促進細胞存活

闕嘉麗， 李晨光， 劉可嘉， 余 劍

?

Netrin-1通過下調氧糖剝奪誘導的人神經母細胞瘤自噬促進細胞存活

闕嘉麗， 李晨光， 劉可嘉， 余 劍

目的 通過建立體外人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)氧糖剝奪(oxygen and glucose deprication，OGD)模型模擬腦梗死后神經元缺血缺氧環境(OGD)，探索神經導向因子Netrin-1是否影響OGD后細胞的生存，以及自噬在其中的可能作用。方法 體外培養SH-SY5Y細胞，檢測Netrin-1對細胞活性及自噬的影響。使用自噬誘導劑雷帕霉素、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤干預自噬水平，同時構建過表達Netrin-1受體UNC5H2-HA基因的HEK293T細胞；CCK-8試劑盒檢測細胞活性，免疫印跡檢測自噬相關標志物(Beclin 1、LC3、p62)的表達及免疫熒光檢測LC3斑點的形成。結果 與OGD對照組相比，Netrin-1及3-甲基腺嘌呤的干預均顯著提高細胞活性，伴有LC3-Ⅱ斑點形成減少；相反，雷帕霉素增加LC3-Ⅱ斑點的同時抑制細胞活性，并減弱了Netrin-1提高細胞活性的作用。過表達UNC5H2-HA細胞較對照質粒組相比，LC3-Ⅱ表達增加；同時進行Netrin-1干預后僅過表達組出現LC3-Ⅱ表達下降，p62表達上升。結論 Netrin-1可能通過受體UNC5H2下調OGD損傷的人神經母細胞瘤自噬而提高細胞活性。

Netrin-1； 氧糖剝奪； 自噬； UNC5H2

腦卒中是導致我國成人殘疾和死亡的第一原因[1]。腦梗死后神經元自噬過程被激活，研究發現降低自噬活性能夠降低神經元死亡數量，減小梗死面積并促進神經功能恢復[2,3]，但其調節因素尚未完全闡明。作為一種神經導向因子，Netrin-1不僅在發育中神經系統調節細胞遷移黏附[4]，而且在成年后與依賴性受體UNC5H2結合后，顯著地減少腦卒中后細胞凋亡，并改善運動功能恢復[5～7]，提示其在腦保護作用上具有治療潛能。

進一步地研究顯示Netrin-1在減少缺血導致心肌細胞死亡的同時也顯著地降低了自噬活性[8]，但在腦梗死后尚缺乏兩者的研究。

本實驗利用穩定表達Netrin-1及其受體UNC5H2的人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)建立模擬腦梗死環境的體外氧糖剝奪細胞模型[9,10]，同時構建UNC5H2過表達的HEK 293T細胞系，旨在探討Netrin-1對缺氧損傷后自噬及細胞活性的調節作用，以及其受體UNC5H2對細胞自噬的影響，為Netrin-1的腦保護作用探尋新的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及建立過表達體系 人神經母細胞瘤(SH-SY5Y)、HEK 293T細胞購自American Type Culture Collection(ATCC)公司。細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基(Gibco)中，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。每2～3 d更換培養液一次，生長達80%融合時傳代，取第2-7代細胞分組進行實驗。HEK 293T細胞按104/ml的密度種植于六孔板及培養皿中，12 h貼壁后，按Lipofectamine 3000(Life Technologies)說明書步驟瞬轉UNC5H2-HA-tag質粒及對照質粒(吉凱生物),使用HA抗體(1∶1000，Abcam)進行免疫熒光法測定轉染效率，觀察計數100個細胞并計算帶綠色熒光的細胞的比例。

1.2 OGD模型建立 該模型用于模擬體內腦梗死環境并進行自噬和細胞活性檢測[11]。SH-SY5Y按105/ml正常接種于96孔板后，吸凈原有培養基，更換成DMEM無糖培養基(Gibco)，置于含有氧氣指示劑(日本三菱)的缺氧罐內，使用真空抽氣泵抽空罐內空氣后，通入由95%N2及5%CO2組成的混合氣體，反復抽吸3次構建缺氧環境，氧氣指示劑持續顯示粉紅色表明缺氧過程成功，最后將缺氧罐放置在37 ℃恒溫箱中2 h后置于正常氧糖環境中。

1.3 CCK-8試劑盒檢測細胞活性 SH-SY5Y接種于96孔板中，接種密度為105/孔，設6個復孔，培養24 h后細胞貼壁，分別加入以下藥物：對照組(不加藥)；Netrin-1組(50 ng/ml)；自噬誘導劑雷帕霉素組(Rapamycin,RAPA,50 nmol/L)；Netrin-1+RAPA組；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA,1mmol/L)；Netrin-1+3-MA組。藥物預處理2 h后置于OGD模型中，2 h后每孔加入10 μl CCK-8(日本同仁)，37 ℃孵育1.5 h后用酶標儀在450 mm波長下進行比色，計算相對吸光度，吸光度越高，細胞活性越高。

1.4 免疫熒光檢測自噬標記物LC3斑點形成 SH-SY5Y經100%甲醇固定15 min，0.01 mol PBS搖床洗5 min 3次，加入封閉液封閉1 h后孵育兔抗大鼠LC3一抗(1∶100，CST)檢測LC3斑點形成，4 ℃冰箱放置過夜，加入delight 555標記的山羊抗兔熒光二抗(1∶600，CST)室溫孵育1 h后再漂洗，封片后于共聚焦顯微鏡下拍照。

1.5 Western blot HEK 293T細胞用細胞裂解液(博彩生物)提取蛋白，BCA試劑盒(Thermo)進行蛋白定量測定，蛋白樣品(每孔40 μg)進行12% SDS-PAGE垂直電泳，恒流轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗人一抗UNC5B、Beclin 1、p62、LC3及GAPDH，4 ℃孵育過夜，次日加入抗兔二抗室溫孵育1 h，加入化學發光HRP底物(Millipore)于熒光化學發光成像分析系統(Image Quant Las4000 mini)中曝光成像，采用Quantity One 分析條帶灰值。

2 結 果

2.1 CCK8檢測細胞活性 各組經OGD處理后，與OGD對照組(0.63±0.03)相比，Netrin-1組(0.77±0.04)、3-MA組(0.76±0.03)以及3-MA+Netrin-1組(0.77±0.04)明顯增強SH-SY5Y活性(P均<0.05)；而RAPA組(0.63±0.01)對細胞活性影響不明顯；與Netrin-1組相比，RAPA+Netrin-1組(0.65±0.02)的細胞活性下降(P<0.05)(見圖1)，表明50 nmol/L RAPA能夠有效減弱OGD后Netrin-1對細胞活性的增強作用，而3-MA對此無明顯影響。

2.2 免疫熒光檢測LC3斑點形成 微管相關蛋白LC3是自噬標志物。自噬小體形成時，胞漿型LC3即LC3-I與磷脂酰乙醇胺共價結合，形成結合在自噬小體膜上的斑點狀LC3-Ⅱ(見圖2)。OGD時SH-SY5Y胞質中可見大量LC3斑點形成，RAPA作用后斑點明顯增加，但Netrin-1組及3-MA組、Netrin-1+3-MA組則出現斑點數目明顯減少，提示Netrin-1減輕SH-SY5Y自噬活性。另外，Netrin-1+RAPA組的斑點數較Netrin-1組增加。

2.3 Western blot 過表達UNC5H2-HA組較對照質粒組LC3-Ⅱ/GAPDH比值增高(P<0.05)；對照質粒組中進行Netrin-1干預對自噬標志物無明顯變化，而在UNC5H2-HA組中Netrin-1干預使LC3-Ⅱ相對比值下降，及Beclin 1相對下降，p62相對升高(P<0.05)，提示細胞自噬活性降低(見圖3)。

與對照組相比*P<0.05；與Netrin-1組相比#P<0.05

圖1 CCK8試劑盒檢測細胞活性

A：對照組；B：RAPA組；C：3-MA組；D：Netrin-1組；E：RAPA+Netrin-1組；F：3-MA+Netrin-1組 紅色熒光為LC3-Ⅱ蛋白，藍色熒光為細胞核，1000×，標尺=5μm

圖2 LC3免疫熒光染色

A：蛋白泳道從左到右：vehicle組,vehicle組+Netrin-1，UNC5H2-HA組，UNC5H2-HA組+Netrin-1；B：Beclin 1蛋白的相對比值變化；C：p62蛋白的相對比值變化；D：LC3-Ⅱ蛋白的相對比值變化與vehicle對照組相比*P<0.05； 與UNC5H2-HA組相比#P<0.05

圖3 過表達UNC5H2-HA及添加Netrin-1后的自噬標志物表達改變

3 討 論

本實驗通過對SH-SY5Y細胞活性和自噬相關標志物LC3的檢測，結果發現，OGD后SH-SY5Y自噬增強，細胞活性降低，而給予Netrin-1預處理后，自噬明顯減弱并伴細胞活性增強，這種增強作用可被自噬誘導劑RAPA所減弱。另外，過表達UNC5H2的HEK 293T細胞也出現自噬增強，并且Netrin-1僅減弱該過表達系的自噬活性，提示Netrin-1在體外對OGD后的SH-SY5Y生存具有保護作用，且該保護作用可能通過UNC5H2介導降低自噬而實現。

自噬過程與細胞死亡密切相關，并受mTOR、PI3K等多種因素調控，適量的自噬有助于適應外界刺激促進細胞存活，而過量的自噬則有可能加速細胞的死亡[12,13]。腦梗死后早期病灶周圍神經元自噬即顯著增強，但其作用尚存爭議。一般認為這種自噬激活是一種損傷機制[14]。注射自噬抑制劑[10,15]或敲除自噬相關基因Beclin 1[16]后均可減少腦梗死面積并改善神經功能；但也有實驗認為自噬激活具有保護作用，在側腦室注入自噬抑制劑預處理后腦梗死面積反而增大[17]，這可能與所使用的動物模型、藥物劑量和觀測時間點等不同相關[15,17]。本實驗采用的神經源性細胞SH-SY5Y與原代神經元自噬活性相當，采用的50 nmol/L的RAPA和1 mmol/L的3-MA在保留有效調控自噬的同時可盡量避免對細胞造成損傷[18]。在該條件下通過觀察OGD后自噬對SH-SY5Y的影響，發現OGD后自噬增強不利于該細胞的生存，而Netrin-1對其生存的促進作用則是通過減弱這種自噬來實現的，表現為LC3的減低和p62的增高。

已經發現過表達Netrin-1能夠減少腦缺血導致的神經元死亡并改善神經功能恢復[5～7]，同時，Netrin-1與其依賴性受體UNC5H2結合后能抑制細胞凋亡，促進細胞存活[19]。為進一步了解是否UNC5H2也介導Netrin-1對自噬的調節作用，我們構建了過表達UNC5H2的HEK 293T細胞系，結果發現過表達UNC5H2明顯提高細胞的自噬活性，而同時給予Netrin-1干預后可減低這種自噬活性，提示Netrin-1/UNC5H2可能是自噬調節中的重要因素。

有研究發現UNC5在線蟲神經元中與自噬相關基因UNC-51及UNC-14密切相關，后兩者可協同定位UNC-5的亞細胞結構，并引導神經元生長[20]。另外，Netrin-1/UNC5H2介導的細胞存活的下游分子DAPK[21]也可能通過激活Beclin 1而啟動自噬途徑[22]，但其機制仍有待進一步闡明。本實驗沒有檢測Netrin-1的其他受體，如DCC、neoginin等，尚不能除外這些受體也在Netrin-1對自噬的調控起作用，這有待于今后深入研究。

[1]中華醫學會神經病學分會,中華醫學會神經病學分會腦血管病學組.中國急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經科雜志,2015,48(4):246-257.

[2]Tian F,Deguchi K,Yamashita T,et al.In vivo imaging of autophagy in a mouse stroke model[J].Autophagy,2010,6(8):1107-1114.

[3]Rami A.Upregulation of Beclin 1 in the ischemic penumbra[J].Autophagy,2008,4(2):227-229.

[4]Ko SY,Dass CR,Nurgali K.Netrin-1 in the developing enteric nervous system and colorectal cancer[J].Trends Mol Med,2012,18(9):544-554.

[5]Lu H,Wang Y,He X,et al.Netrin-1 hyperexpression in mouse brain promotes angiogenesis and long-term neurological recovery after transient focal ischemia[J].Stroke,2012,43(3):838-843.

[6]Sun H,Le T,Chang TT,et al.AAV-mediated netrin-1 overexpression increases peri-infarct blood vessel density and improves motor function recovery after experimental stroke[J].Neurobiol Dis,2011,44(1):73-83.

[7]Lu H,Wang Y,Yuan F,et al.Overexpression of netrin-1 improves neurological outcomes in mice following transient middle cerebral artery occlusion[J].Front Med,2011,5(1):86-93.

[8]Bouhidel JO,Wang P,Siu KL,et al.Netrin-1 improves post-injury cardiac function in vivo via DCC/NO-dependent preservation of mitochondrial integrity,while attenuating autophagy[J].Biochim Biophys Acta,2015,1852(2):277-289.

[9]Goldberg MP,Choi DW.Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture:calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury[J].J Neurosci,1993,13(8):3510-3524.

[10]Shi R,Weng J,Zhao L,et al.Excessive autophagy contributes to neuron death in cerebral ischemia[J].CNS Neurosci Ther,2012,18(3):250-260.

[11]Luo T,Liu G,Ma H,et al.Inhibition of autophagy via activation of PI3K/Akt pathway contributes to the protection of ginsenoside Rb1 against neuronal death caused by ischemic insults[J].Int J Mol Sci,2014,15(9):15426-15442.

[12]Oral O,Akkoc Y,Bayraktar O,et al.Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis[J].Histol Histopathol,2016,31(5):479-498.

[13]Tovary-Romo LB,Penagos-Puig A,Ramirez-Jarquin JO.Endogenous recovery after brain damage:molecular mechanisms that balance neuronal life/death fate[J].J Neurochem,2016,136(1):13-27.

[14]Wei K,Wang P,Miao CY.A double-edged sword with therapeutic potential: an updated role of autophagy in ischemic cerebral injury[J].CNS Neurosci Ther,2012,18(11):879-886.

[15]Wen YD,Sheng R,Zhang LS,et al.Neuronal injury in rat model of permanent focal cerebral ischemia is associated with activation of autophagic and lysosomal pathways[J].Autophagy,2008,4(6):762-769.

[16]Zheng YQ,Liu JX,Li XZ,et al.RNA interference-mediated downregulation of Beclin1 attenuates cerebral ischemic injury in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2009,30(7):919-927.

[17]Carloni S,Buonocore G,Balduini W.Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury[J].Neurobiol Dis,2008,32(3):329-339.

[18]李治國,張繼紅,張錦華.mTOR通路對神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞自噬作用的影響[J].現代腫瘤醫學,2014,10:2278-2280.

[19]Wu TW,Li WW,Li H.Netrin-1 attenuates ischemic stroke-induced apoptosis[J].Neuroscience,2008,156(3):475-482.

[20]Ogura K,Goshima Y.The autophagy-related kinase UNC-51 and its binding partner UNC-14 regulate the subcellular localization of the Netrin receptor UNC-5 in Caenorhabditis elegans[J].Development,2006,133(17):3441-3450.

[21]Llambi F,Lourenco FC,Gozuacik D,et al.The dependence receptor UNC5H2 mediates apoptosis through DAP-kinase[J].EMBO J,2005,24(6):1192-1201.

[22]Bialik S,Kimchi A.Lethal weapons:DAP-kinase,autophagy and cell death:DAP-kinase regulates autophagy[J].Curr Opin Cell Biol,2010,22(2):199-205.

Netrin-1 protects SH-SY5Y neuroblastoma cells from oxygen-glucose deprivation by attenuating autophagy

QUE Jiali,LI Chenguang,LIU Kejia,et al.

(Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China)

Objective To mimic hypoxic and ischemia environment caused by stroke,in vitro oxygen-glucose deprivation (OGD) model was established.The aim is to explore whether axon guidance factor Netrin-1 protectes SH-SY5Y neuroblastoma cells from OGD by regulating autophagy.Methods SH-SY5Ys were pretreated with Netrin-1 before OGD，apply applied autophagy inducer rapamycin and autophagy inhibitor 3-methyladeni-ne (3-MA) to modulate the autophagy flow,and transient transfected HEK 293T cell with UNC5H2-HA plasmid;cell viability was examined in CCK8 assay,western Western blot detected the autophagy markers (Beclin1,LC3,p62) and immunofluorescence detected punctuate LC3.Results We found that Netrin-1 improved cell viability and decreased the expression of LC3-Ⅱ,a protein related to autophagosome formation,in a manner sensitive to RAPA co-treatment.Additionally,the ability of Netrin-1 to decrease the expression of LC3-Ⅱ was present in UNC5H2-overexpressing HEK 293T cells but not vehivle-transfected cells,indicated the importance of Netrin-1-UNC5H2 interaction to this effect.Conclusion These results indicate that Netrin-1 may improve cell survival by attenuat-ing autophagy via UNC5H2.

Netrin-1; Oxygen-glucose derivation; Autophagy; UNC5H2

1003-2754(2016)06-513-04

2016-02-23；

2016-05-29

國家自然科學基金(No.81371276)；廣東省自然科學基金(No.2014A030313065)；廣東省重大神經疾病診治研究重點實驗室(No.2014B030301035)

(中山大學附屬第一醫院神經科，衛生部國家臨床重點專科，教育部國家重點專科，廣東 廣州 510080)

余 劍，E-mail：yujian21cn@163.com

R739.4

A