MiR-615-5p緩解Aβ25-35誘導的APOE4+/-型海馬細胞的凋亡和變性

姚 婕， 馬巧亞， 閻麗萍， 張紅梅， 姬文濤

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MiR-615-5p緩解Aβ25-35誘導的APOE4+/-型海馬細胞的凋亡和變性

姚 婕， 馬巧亞， 閻麗萍， 張紅梅， 姬文濤

目的 探討miR-615-5p對人海馬細胞的凋亡和變性的影響及潛在機制。方法 運用實時定量PCR檢測正常、家族性AD和散發性AD老年人血液中miR-615-5p的表達水平，以及APOE4+/-型人胚海馬細胞和Aβ誘導的APOE4+/-海馬細胞中miR-615-5p的表達水平；在Aβ預處理的APOE4+/-型海馬細胞中分別轉染miR-615-5p mimic和inhibitor后檢測細胞凋亡、氧化應激標志物含量和突觸生長標志蛋白的表達水平；運用生物學信息分析和熒光素酶報告基因技術預測并驗證mir-615-5p對APOE基因的靶定調控關系。結果 散發性AD患者和細胞模型中miR-615-5p的表達水平顯著下調；過表達miR-615-5p顯著抑制海馬細胞的凋亡和細胞內氧化應激，并促進細胞內突觸生長蛋白的表達，而沉默miR-615-5p則作用相反；mir-615-5p可靶定結合APOE mRNA，并下調APOE4+/-海馬細胞中APOE4蛋白的表達。結論 mir-615-5p通過靶向調節APOE，緩解Aβ25-35誘導的APOE4+/-型海馬細胞的凋亡和變性。

mir-615-5p； 阿爾茨海默病； 載脂蛋白4； 細胞凋亡； 氧化應激

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種嚴重危害老年人身心健康的神經系統退行性疾病，從最初的記憶減退，到失語、失聰、失用、失明，乃至最終的人格和行為完全改變[1]。我國人口日趨老齡化，AD造成的家庭負擔和社會負擔也隨之凸顯。近年來，大量臨床和基礎研究表明β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)在腦內的進行性沉積是AD的一項重要病理特征[2～5]。Aβ由淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)基因的編碼產物經β-或γ-分泌酶水解而成，經運輸進入腦脊液或腦間質液中[2,3]。載脂蛋白E(apolipoprotein E)是機體內運輸脂蛋白和多種多肽的重要功能蛋白[6,7]。APOE的等位基因ε4編碼的蛋白APOE4與Aβ有高度的親和性，在Aβ運輸進入腦脊液的過程中發揮重要作用[6,8,9]。現有研究表明，APOE4表達個體比非APOE4表達個體的AD患病風險至少高4倍，APOE4已成為散發性AD的重要標志物和治療靶點[4,10,11]。

MiR-615-5p是近年來新發現抑癌miRNA，對多種組織器官的癌變細胞的生長和轉移具有抑制作用[12,13]。

最近，有報道顯示miR-615在運動神經元中的表達水平顯著高于脊髓源性神經干細胞[14]，提示其在神經細胞分化和功能形成過程中發揮潛在作用。本研究對比正常、家族性AD和散發性AD老年人血液中miR-615-5p的表達水平，發現miR-615-5p散發性AD老年患者血液中表達水平顯著降低；進一步在APOE4+/-型人胚海馬細胞中探索miR-615-5p對Aβ25-35誘導的海馬神經元的凋亡和功能的影響，以期為散發性AD的治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 磷酸緩沖鹽溶液PBS、青-鏈霉素購自天津寶鑫生物；Hoechst33258細胞凋亡染色劑、Aβ25-35、Aβ1-42、熒光素酶報告基因檢測試劑盒、膽堿乙酰轉移酶活性CAT檢測試劑盒、丙二醛MDA含量測定試劑盒、活性氧ROS含量測定試劑盒、表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自美國Sigma公司；脂質體3000轉染試劑、DMEM/F12培養基、N2、B27、胎牛血清 (FBS)、膠原酶I、胰蛋白酶等購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自北京天根生化科技公司；實時定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；PVDF膜、ECL蛋白發光檢測試劑盒購自美國Millipore公司；兔抗小鼠caspase-3抗體、兔抗小鼠caspase-9抗體、兔抗小鼠GAP-43抗體、兔抗小鼠Syn抗體、兔抗小鼠APOE4抗體、兔抗小鼠Aβ抗體和兔抗小鼠β-tululin抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG購自英國Abcam公司；細胞培養板、培養瓶和其他細胞培養耗材購自南京賽業公司；miR-615-5p反轉錄試劑盒(含特異性反轉錄引物)和miR-615-5p實時定量試劑盒(含miR-615-5p上下游檢測引物和內參基因U6 RNA引物)由廣州銳博生物技術有限公司提供；2’-甲氧基修飾的單鏈miR-615-5p 模擬寡核苷酸(mimic)、抑制寡核苷酸(inhibitor)和陰性對照寡核苷酸NC由瑞士Roche公司設計、合成并進行有效性檢測(最適濃度為60 nmol)；其他試劑均為進口或國產分析純。Bio-Rad實時定量PCR儀、凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 倫理學聲明 本研究的方案經由西安交通大學倫理學委員會審核并批準。受試患者和志愿者均被告知詳細情況，并由本人/監護人簽訂書面協議。

1.2.2 血液樣本采集 本研究受試者包括18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散發性AD患者。各組受試者年齡在55～70歲之間，平均年齡63歲左右，受試者中無腦部或全身感染、各類腫瘤、腦部外傷、卒中、癲癇等疾患，無過度瘦弱和過度肥胖者。受試者血液樣本由技術熟練的老年科住院部護士采集，采血在氣溫適宜的早晨(進食前)進行，于每個受試者前臂靜脈采集5 ml左右血液樣本，4 ℃保存備用。

1.2.3 APOE4+/-型人胚海馬細胞的分離培養 APOE4+/-型海馬細胞來源于2012年-2015年間本院的3例稀有病例,12～14 w流產、基因型為APOE4+/-的胚胎。分離雙側海馬， 無血清DMEM/F12培養液清洗后，剔除血管和腦膜后剪成1 mm3左右的小塊，0.125%胰酶、37 ℃消化10～12 min，加入少量含血清培養液終止消化。800 r/min離心 5 min，棄上清；加入適量培養基，800 r/min離心 5 min，棄上清，加入適量DMEM/F12培養液(添加1% N2、2% B27、20 ng/ml bFGF和20 ng/ml EGF)重懸沉淀，接種于細胞培養板上，置 CO2于37 ℃、95%濕度、5%CO2條件的培養箱中培養。1 h后吸取未貼壁神經元，計數后接種105個細胞于6孔培養板中。培養 24 h后更換新培養液，之后每2～3次半量換液，觀察神經元形態和生長情況。培養至10 d左右的細胞用于后續研究。

1.2.4 血液和海馬細胞中miR-615-5p表達水平的檢測 用血液總RNA提取試劑盒和細胞總RNA提取試劑盒分別提取血液樣本和海馬細胞中的總RNA，運用miR-615-5p反轉錄試劑盒合成cDNA，定量試劑盒檢測miR-615-5p表達水平。反應體系為25 μl體系，包括2 μl的cDNA模板(含500 ng cDNA)、上下游定量引物各0.5 μl(終濃度為0.5 μmol/L)、12.5 μl反應緩沖液和9.5 μl超純水。反應條件如下：95 ℃預變性1 min,以95 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸60 s的條件擴增35個循環，Bio-Rad實時定量PCR儀自帶IQ5軟件分析計算擴增循環數Ct值，相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.5 Hoechst 33258染色檢測海馬細胞凋亡 對照和各處理以4%甲醛溶液固定1 h，以預冷的PBS溶液洗滌兩次，添加5 μg/ml Hoechst 33258染液覆蓋細胞樣品，室溫染色4 min。PBS洗滌3次，每次3 min，在熒光顯微鏡下觀察(340 nm激發光)。結果判定標準：活細胞呈彌散、均勻熒光，凋亡內可見濃染、致密的熒光顆粒，有3個或以上的DNA熒光碎片的細胞為凋亡細胞，Epies (R) Porfile Analyzer細胞自動計數軟件對正常細胞和凋亡細胞進行計數，然后計算凋亡細胞比例。

1.2.6 Western印跡法檢測蛋白表達水平 收集各組細胞，總蛋白提取試劑盒提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白含量；配制SDS-PAGE凝膠，每個膠孔上樣50 ng蛋白樣品進行電泳；2.5 h后濕轉法轉膜；室溫下用5%脫脂奶粉緩沖液封閉轉有蛋白的PVDF膜1 h，分別加入兔抗小鼠caspase-3抗體(1∶400)、兔抗小鼠caspase-9抗體(1∶400)、兔抗小鼠GAP-43抗體(1∶300)、兔抗小鼠Syn抗體(1∶300)、兔抗小鼠APOE4抗體(1∶200)、兔抗小鼠Aβ抗體(1∶200)和兔抗小鼠β-tululin抗體(1∶800)，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10 min；加HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶1000)，室溫孵育2 h；TBST清洗4次，每次8 min，孵育ECL發光液，于凝膠成像系統中曝光顯影、采集圖像， Quantity One軟件進行條帶分析，重復3次以上。

1.2.7 CAT活性、ROS和MDA水平的檢測 收集各組細胞，離心棄上清，分別運用膽堿乙酰轉移酶活性CAT檢測試劑盒、丙二醛MDA含量測定試劑盒、活性氧ROS含量測定試劑盒檢測細胞中CAT的活性及ROS、MDA的含量，按照試劑盒說明書進行逐步操作。

1.2.8 熒光素酶報告基因技術驗證miR-615-5p對APOE基因的靶定 擴增APOE mRNA的3’非翻譯區(3’untranslated region，3’UTR)全長，連接于pGL3雙熒光素酶報告基因載體上；將構建好的載體單獨或與miR-615-5p mimic共同轉染于APOE4+/-型人胚海馬細胞中，孵育72 h，按熒光素酶報告基因分析試劑盒中所述步驟進行操作，以多功能酶標儀檢測熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 散發性AD患者血液中miR-615-5p的表達水平顯著下調 實時定量PCR檢測18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散發性AD患者血液中miR-615-5p的表達水平，結果顯示家族性AD患者血液中miR-615-5p的表達水平與非AD志愿者基本一致(P>0.05)，散發性AD患者血液中miR-615-5 p的表達水平顯著低于非AD志愿者(P<0.01)(見圖1A)。

2.2 Aβ處理降低AD細胞模型中miR-615-5 p的表達水平 分別以50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42、10 μmol Aβ25-35和等體積PBS(作為對照)處理APOE4+/-型人胚海馬細胞(見圖1B),Hoechst 33258染色結果所示，對照組中部分細胞內呈現濃染致密顆粒塊狀熒光(指示凋亡細胞)，KCl 處理后細胞內多呈彌散均勻熒光，而Aβ1-42 或Aβ25-35處理后致密顆粒塊狀熒光增多(見圖1B)。同時實時定量PCR分析結果顯示，KCl處理促進細胞中miR-615-5p的表達水平，而Aβ處理降低細胞中miR-615-5p的表達水平(見圖1C)。

2.3 miR-615-5p抑制Aβ誘導的APOE4+/-型海馬細胞凋亡 在Aβ預處理的APOE4+/-型海馬細胞中分別轉染miR-615-5p mimic和inhibitor，mimic轉染組細胞中miR-615-5 p的表達水平提高至4倍以上(P<0.05)，inhibitor轉染組細胞中miR-615-5 p的表達水平下降至30%左右(P<0.05，見圖2A)。細胞凋亡檢測結果顯示，mimic轉染組凋亡細胞的比例顯著下降，而inhibitor轉染組凋亡細胞的比例顯著上升(P<0.05，見圖2B)；凋亡關鍵基因表達檢測結果顯示，mimic轉染抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和9的表達，而inhibitor轉染則促進caspase-3和9的表達(見圖2C)。

2.4 miR-615-5p緩解Aβ誘導的APOE4+/-型海馬細胞氧化應激、促進突觸生長 分別檢測轉染后各組細胞中氧化應激標志物水平，結果(見表1)，miR-615-5p mimic轉染提高APOE4+/-海馬細胞中膽堿乙酰轉移酶(Choline acetyltransferase，CAT)的活性(P<0.05)，減少活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的產生(P<0.05)，有助于緩解細胞內氧化應激。此外，免疫印跡定量檢測發現miR-615-5p mimic促進突觸生長標志因子GAP-43(生長相關蛋白-43，growth associated protein)和Syn(突觸素，synaptophysin)的表達(P<0.05)。miR-615-5p inhibitor的作用則與miR-615-5p mimic相反(見表2)。

2.5 miR-615-5p靶向結合并抑制APOE4+/-型海馬細胞中APOE4蛋白的表達 我們運用靶基因預測軟件TargetScan和miRDB預測到mir-615-5p可結合APOE mRNA的3’UTR區域，隨后運用熒光素酶報告基因分析驗證二者的結合，轉入mir-615-5p mimic后熒光素酶活性降低(見圖3A)，表明APOE4是mir-615-5p的靶基因。在APOE4+/-型海馬細胞中轉染mir-615-5p mimic后，APOE4蛋白表達水平下降，Aβ含量也下降；mir-615-5p inhibitor轉染則促進APOE4蛋白的表達，增加Aβ含量(見圖3B)。

表1 miR-615-5p表達變化對Aβ25-35預處理的APOE4+/-型人胚海馬細胞氧化應激水平的影響

與對照組(Aβ25-35處理組)比較*P<0.05

表2 miR-615-5p表達變化對APOE4+/-型人胚海馬細胞突觸生長標志因子表達水平的影響

與對照組(Aβ25-35處理組)比較*P<0.05

A.18名非AD志愿者、25名家族性AD患者和25名散發性AD患者血液中miR-615-5p的表達水平對比；B.50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42和10 μmol Aβ25-35分別處理APOE4+/-型人胚海馬細胞24 h后Hoechst 33258染色；C.50 mmol KCl、10 μmol Aβ1-42和10 μmol Aβ25-35分別處理APOE4+/-型人胚海馬細胞24 h后miR-615-5p的表達水平變化.與正常(對照)組比較aP<0.05,aaP<0.01

圖1 AD患者血液及散發性AD細胞模型中miR-615-5p表達水平的檢測

A.60 nmol miR-615-5p mimic和inhibitor分別轉染Aβ25-35預處理的APOE4+/-型人胚海馬細胞72 h后miR-615-5p的表達水平變化；B.miR-615-5p mimic和inhibitor轉染對細胞凋亡的影響；C.miR-615-5p mimic和inhibitor轉染后細胞凋亡蛋白caspase-9和caspase-3的水平變化.與 Aβ25-35處理組比較aP<0.05

圖2 miR-615-5p對Aβ預處理的APOE4+/-型海馬細胞的凋亡的影響

A.熒光素酶報告基因技術驗證miR-615-5p與APOE基因的靶定結合;B.miR-615-5p mimic和inhibitor轉染后APOE4+/-型海馬細胞中APOE4蛋白和Aβ含量變化

圖3 miR-615-5p靶定APOE基因并抑制APOE4+/-型海馬細胞中APOE4的表達

3 討 論

自2007發現迄今，miR-615-5p功能報道多見于內臟癌組織細胞的生長和轉移的研究中，被鑒定為具有抑癌作用的miRNA。索耀君等首次探討miR-615在脊髓源性神經干細胞與運動神經元間的表達特征[14]，發現miR-615在分離的運動神經元中顯著高表達，揭開了miR-615在神經系統功能和發育調控研究的序幕。本研究以AD患者和散發性AD細胞模型為研究對象，檢測并對比正常、家族性AD和散發性AD老年人血液中miR-615-5p的表達水平，以及APOE4+/-型海馬細胞和Aβ誘導的APOE4+/-海馬細胞中miR-615-5p的表達水平，散發性AD患者和細胞模型中miR-615-5p的表達水平顯著下調，提示miR-615-5p在散發性AD進程中可能發揮調控作用。

AD發病機制在細胞和分子水平主要體現為Aβ等大量積累引起的細胞凋亡增加、氧化應激和炎癥水平劇增和神經突觸生長抑制[15～17]。在Aβ預處理的APOE4+/-型海馬細胞中以轉染miR-615-5p mimic和inhibitor的方式過表達或沉默miR-615-5p，發現過表達miR-615-5p顯著抑制海馬細胞的凋亡和細胞內氧化應激，并促進細胞內突觸生長標志因子的表達，而沉默miR-615-5p則對細胞凋亡、氧化應激和突觸生長因子表達有相反的結果。因此，本文從正反兩方面表明miR-615-5p對散發性AD細胞模型就有保護作用。

眾所周知，miRNA的生物學作用由其靶定基因的生物學功能決定。在肝癌細胞中，miR-615-5p通過靶定調節胰島素樣生長因子2抑制癌細胞的增殖和轉移[18]；在胰腺癌中和乳腺癌中，miR-615-5p的作用靶點為促進細胞增殖的Akt2基因[12]；最近一項關于非小細胞肺癌的研究證實miR-615-5p可靶定結合并抑制腫瘤壞死因子相關蛋白4基因從而抑制肺癌細胞增殖[19]。APOE4是散發性AD的重要標志，APOE4高表達會加速Aβ進入腦脊液的運輸過程，從而加速AD的進程[9,20,21]。本研究以APOE4等位基因為靶點，通過生物信息學工具對miR-615-5p和APOE的調控關系進行預測，TargetScan和miRanda的輸出結果均表明APOE是miR-615-5p的潛在靶基因，隨后熒光素酶報告基因檢測和過表達后APOE4表達檢測結果也都證實APOE是miR-615-5p的靶基因，這也揭示了miR-615-5p能夠緩解APOE4+/-海馬細胞氧化應激和細胞凋亡，并促進細胞突觸生長蛋白表達的原因。

綜上所述，miR-615-5p在散發性AD患者和細胞模型中表達水平顯著下調，可靶定結合并抑制APOE基因表達，從而緩解Aβ25-35誘導的APOE4+/-型海馬細胞的凋亡和變性。

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MiR-615-5p alleviates the apoptosis and degeneration of Aβ25-35-induced APOE4+/-hippocampus cells

YAO Jie,MA Qiaoya,YAN Liping,et al.[the First Ward of Cadre Ward

(Department of Aged Neurology),the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiao Tong University,Xi’an 710004,China]

Objective Apolipoprotein E4 (apoE4) to explore the regulatory role and mechanism of miR-615-5p in the apoptosis and function of human hippocampus cells.Methods Expression of blood miR-615-5p were detected with real-time qPCR in familial Alzheimer’s disease (AD) patients,sporadic AD patients and non-AD aged volunteers,as well as APOE4+/- human embryonic hippocampus cells and Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells;the mir-615-5p mimic or inhibitor was transfected into the Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells,and then cell apoptosis,oxidative stress level and synaptic growth protein expression were detected;bioinformatics and luciferase reporter gene analyses were applied to evaluate and validate the targeting relationship between miR-615-5p and APOE4.Results MiR-615-5p was significantly decreased in sporadic AD patients and Aβ-pretreated APOE4+/-hippocampus cells;mir-615-5p mimic transfection suppressed cell apoptosis and oxidative stress,and promoted the expression of synaptic growth proteins;in contrast,mir-615-5p inhibitor transfection had an opposite effect; APOE mRNA was targeted by mir-615-5p and APOE4 protein level in APOE4+/-hippocampus cells was suppressed by mir-615-5p mimic transfection.Conclusion MiR-615-5p alleviates the apoptosis and degeneration of Aβ25-35-induced APOE4+/-hippocampus cells.

miR-615-5p; Alzheimer’s disease; APOE4; Cell apoptosis; Oxidative stress

1003-2754(2016)06-0540-05

2016-04-06；

2016-05-30

[西安交通大學第二附屬醫院干部病房一病區(老年神經科)，陜西 西安 710004]

馬巧亞，E-mail：huiqingguohn@163.com

R734.2;Q752;Q291

A