Nec-1在小鼠腦出血中通過(guò)抑制程序性壞死發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

常 盼， 于 軍， 張明陽(yáng)， 朱妙章， 鐵 茹， 張學(xué)策， 趙海康， 單海燕

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Nec-1在小鼠腦出血中通過(guò)抑制程序性壞死發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

常 盼1，3， 于 軍1， 張明陽(yáng)2， 朱妙章3， 鐵 茹1， 張學(xué)策1， 趙海康4， 單海燕5

目的 研究程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1對(duì)小鼠腦出血神經(jīng)功能的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制。方法 選取健康雄性ICR小鼠，體重25～30 g，采用在紋狀體部位注射膠原酶Ⅳ或生理鹽水的方法建立小鼠腦出血組或者腦出血對(duì)照組，在腦出血前15 min 分別在側(cè)腦室注射Nec-1溶液或vehicle溶液。將實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為：對(duì)照組、腦出血+vehicle處理組、腦出血+ Nec-1處理組。分別利用干濕重法測(cè)定腦水腫程度，神經(jīng)功能評(píng)分檢測(cè)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，Western blotting檢測(cè)cleaved caspase-3，Bcl-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 腦出血加劇腦水腫程度，而 Nec-1處理組減輕腦水腫程度(P<0.05)。經(jīng)Nec-1處理后，可以提高小鼠腦出血神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能(P<0.05)。腦出血可以增加cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，經(jīng) Nec-1處理后，抑制cleaved caspase-3的表達(dá)水平(P<0.05)，增加Bcl-2的表達(dá) (P<0.05)。結(jié)論 Nec-1對(duì)腦出血發(fā)揮重要神經(jīng)保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制凋亡通路實(shí)現(xiàn)的，提示程序性壞死在腦出血中具有重要作用，將為腦出血的治療提供新的思路。

Nec-1； 腦出血； 程序性壞死； cleaved caspase-3； Bcl-2

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，占所有住院腦卒中患者的10%～30%，具有很高的病死率和致殘率，6 m的病死率達(dá)30%～50%[1，2]。腦出血后的腦損傷機(jī)制很復(fù)雜，目前腦出血的治療沒(méi)有突破性進(jìn)展。程序性壞死作為一種程序性細(xì)胞死亡方式，參與多種神經(jīng)損傷疾病中，但在腦出血中的作用仍不清楚。有研究者發(fā)現(xiàn)程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1可以減少腦缺血中腦組織梗死體積[3，4]，除此之外，Nec-1能夠減小腦外傷后的細(xì)胞損傷數(shù)，甚至可以改善腦外傷引起的神經(jīng)功能障礙[5]，但Nec-1對(duì)腦出血的作用仍不清楚，且Nec-1發(fā)揮神經(jīng)作用的機(jī)制仍未見(jiàn)報(bào)道。

為此，本研究擬通過(guò)檢測(cè)Nec-1對(duì)小鼠腦出血神經(jīng)功能的影響，以及其對(duì)凋亡的影響，研究Nec-1對(duì)小鼠腦出血神經(jīng)作用及其相關(guān)機(jī)制，旨在為進(jìn)一步研究腦出血的治療方案提供新靶點(diǎn)，以期為腦出血的生理病理機(jī)制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 ICR小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。膠原酶IV(collagenase IV)、caspase-3、Bcl-2購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 腦出血模型建立 小鼠稱重后麻醉，參照Wang等人 方法，剝離右側(cè)顱頂骨膜，固定于小鼠腦立體定位儀上，用顱骨鉆刺一小孔，微量進(jìn)樣器于左側(cè)紋狀體內(nèi)注射膠原酶IV，深度為3.5 mm，于5 min內(nèi)均勻注入后，留針5 min，然后拔針。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 6～8 w齡ICR小鼠(25～30 g)隨機(jī)分成未處理組，處理組(Veh組、Nec-1組)，處理組每組分為24 h和72 h，每組6只，于出血前側(cè)腦室分別注射DMSO溶劑或者Nec-1溶劑。

1.4 腦水腫的測(cè)定 腦水腫的程度可以用腦組織含水量來(lái)表示。小鼠出血后分別在24 h和72 h斷頭取腦后，迅速取出腦組織，去除嗅球和腦干，放于水平面，然后沿正中線切開(kāi)，分離腦皮質(zhì)和紋狀體。小腦作為參考標(biāo)準(zhǔn)也予以測(cè)重。分離得到5部分腦組織：傷側(cè)及對(duì)側(cè)腦皮質(zhì)，傷側(cè)及對(duì)側(cè)紋狀體，小腦。迅速將腦組織放到電子精密天平上稱重得到腦組織的濕重，并記錄，隨后，將腦組織放入100 ℃的烘箱內(nèi)，24 h后取出腦組織并測(cè)量干重。腦組織含水量(%)的計(jì)算方法如下：(濕重-干重)/濕重×100。

1.5 神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的檢測(cè) 運(yùn)動(dòng)功能在出血前1 d及出血后1～7 d 進(jìn)行檢測(cè)。將實(shí)驗(yàn)小鼠的尾巴用手抓住，讓它的兩個(gè)前爪抓住線的中間，每只小鼠從前部、左側(cè)及右側(cè)3個(gè)不同的方向重復(fù)操作3次，按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，記錄分?jǐn)?shù)，并計(jì)算平均分。

1.6 腦組織中caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)量的測(cè)定 分別在腦出血后24 h 和72 h，將各組小鼠用水合氯醛麻醉，斷頭取腦，在腦模中按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)取出血腦組織，加入組織裂解液，超聲細(xì)胞破碎儀低溫勻漿，抽取上清，BCA法測(cè)蛋白含量后，進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Nec-1對(duì)腦出血后腦水腫的影響 在腦出血24 h后，Nec-1組與vehicle組相比，可以減少出血側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)腦水腫的程度(P<0.05)，而對(duì)側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)腦水腫程度無(wú)差異，小腦的水腫程度也未改變。表明經(jīng)Nec-1處理后可以減輕腦出血后的腦水腫程度(見(jiàn)圖1)。

2.2 Nec-1對(duì)腦出血后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的影響 腦出血后1 w內(nèi)小鼠運(yùn)動(dòng)功能減退，Nec-1處理后有助于提高出血后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)(P<0.05)。表明經(jīng)Nec-1處理有助于提高腦出血后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)(見(jiàn)圖2)。

2.3 Nec-1對(duì)腦出血后cleaved caspase-3(CC3)表達(dá)的影響 腦出血24 h和48 h后CC3表達(dá)增加(P<0.05)，Nec-1處理后降低CC3的表達(dá)(P<0.05)，表明Nec-1可以降低腦出血后CC3的表達(dá)(見(jiàn)圖3)。

2.4 Nec-1對(duì)腦出血后Bcl-2表達(dá)的影響 腦出血24 h 和48 h后抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，而Nec-1處理組可以增加Bcl-2蛋白的表達(dá)量(P<0.05)，表明Nec-1可以增加腦出血后Bcl-2蛋白的表達(dá)(見(jiàn)圖4)。

與同部位Veh組比較*P<0.05

與Con組比較#P<0.05；與Veh組比較*P<0.05

與同部位Veh組比較*P<0.05

圖3 Nec-1對(duì)腦出血后cleaved caspase-3(CC3)蛋白表達(dá)的影響

與Con組比較#P<0.05；與Veh組比較*P<0.05

3 討 論

隨著我國(guó)社會(huì)人口老齡化加快，腦出血已成為危害我國(guó)中老年人身體健康和生命的主要疾病之一。盡管有關(guān)腦出血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制得到深入研究，但迄今為止，臨床上腦出血的治療沒(méi)有突破性進(jìn)展。腦出血后的腦損傷機(jī)制很復(fù)雜，其中包括最初的物理?yè)p傷和血腫的占位效應(yīng)所引起的原發(fā)性損傷，以及繼發(fā)性損傷如血腦屏障的破壞、腦水腫、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞的死亡等[1，6]。現(xiàn)已證實(shí)，多種細(xì)胞死亡方式都存在于腦出血的損傷中，但是具體機(jī)制仍不清楚。為了提供新的有效的治療方法，探究腦出血后誘導(dǎo)的大腦損傷的病理機(jī)制尤其是細(xì)胞死亡方式十分重要。

在細(xì)胞的生命周期中，死亡是一個(gè)不可避免而又極其重要的環(huán)節(jié)。細(xì)胞的增殖和死亡之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于多細(xì)胞生物的發(fā)育，以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持都是非常重要的，一旦這種平衡被打破，就會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常、癌癥、自身免疫性疾病和退行性疾病等疾病的發(fā)生。因此，多細(xì)胞生物在進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了一套復(fù)雜而精密的調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)維持這種平衡。細(xì)胞死亡不僅是細(xì)胞的最終命運(yùn)，而且它如同細(xì)胞分裂、增殖一樣，在整個(gè)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育中具有不可替代的作用。隨著對(duì)細(xì)胞死亡機(jī)制的深入研究，細(xì)胞死亡的方式有多種，關(guān)于細(xì)胞死亡的分類目前并不統(tǒng)一，但普遍將受基因調(diào)控、高度有序、主動(dòng)的細(xì)胞死亡方式稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。越來(lái)越多的證明表明，部分細(xì)胞壞死也是程序性細(xì)胞死亡方式中重要的一種[7]。

細(xì)胞壞死是機(jī)體免疫抵御的重要組成部分，也是機(jī)體應(yīng)對(duì)損傷時(shí)用于清理?yè)p傷細(xì)胞的重要方式，細(xì)胞壞死途徑會(huì)通過(guò)激活炎性反應(yīng)來(lái)清除受損細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)容物。但過(guò)量的細(xì)胞壞死會(huì)使得炎性反應(yīng)不斷擴(kuò)大，從而造成不可逆轉(zhuǎn)的組織損傷甚至導(dǎo)致機(jī)體的死亡。人們對(duì)壞死的認(rèn)識(shí)不斷出現(xiàn)新證據(jù)，不僅表明細(xì)胞壞死不同于細(xì)胞凋亡，而且可以由信號(hào)途徑介導(dǎo)。2005年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁均英教授的課題組，發(fā)現(xiàn)一種小分子物質(zhì)Nec-1，可以特異性的抑制細(xì)胞壞死，并將這一種細(xì)胞死亡方式命名為程序性壞死(necroptosis)[8]。研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死是一種受基因調(diào)控、高度有序、主動(dòng)的細(xì)胞死亡形式，受體相互作用蛋白激酶1( receptor interaction protein kinase 1，RIP 1)和受體相互作用蛋白激酶3(receptor interaction protein kinase 3，RIP 3 )是其關(guān)鍵的調(diào)控因子[7，9]。更重要的是越來(lái)越多的證據(jù)，不僅表明細(xì)胞壞死可以由信號(hào)途徑介導(dǎo)，而且還被發(fā)現(xiàn)參與到缺血性心腦血管疾病和神經(jīng)退行性等疾病的病理過(guò)程。例如，有研究者發(fā)現(xiàn)，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1可以減少腦缺血中腦組織梗死體積[3，4]。除此之外，Nec-1能夠可以減小腦外傷后的細(xì)胞損傷數(shù)[5]，甚至可以改善腦外傷引起的神經(jīng)功能障礙，這些結(jié)果提示，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用。可見(jiàn)，程序性壞死這種細(xì)胞死亡方式在各種原因引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷中具有重要的作用，抑制程序性壞死對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。因此，闡明程序性壞死的分子機(jī)制以及研發(fā)有效的抑制劑是非常必要的，為制定有效的治療策略提供強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。

在本研究中，通過(guò)在紋狀體注射膠原酶IV建立腦出血模型，由于腦出血后的機(jī)制非常復(fù)雜，其中血腫周邊的腦水腫是腦出血后最嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷之一，它的發(fā)生和發(fā)展是導(dǎo)致腦出血病情發(fā)展和惡化的重要原因之一[10，11]。因此本研究首先檢測(cè)Nec-1對(duì)腦出血后腦水腫程度的影響，通過(guò)觀察腦出血24 h后Nec-1給藥組和DMSO溶劑對(duì)照組腦水腫的變化，發(fā)現(xiàn)Nec-1可以減少腦水腫程度。為了進(jìn)一步研究Nec-1對(duì)腦出血后的作用，我們應(yīng)用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)Nec-1對(duì)腦出血后神經(jīng)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nec-1有助于腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。這些結(jié)果提示，Nec-1對(duì)腦出血具有神經(jīng)保護(hù)作用，有助于腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

然而，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是腦出血的作用機(jī)制仍不清楚，為了研究Nec-1對(duì)腦出血的作用及機(jī)制，在本次研究中，我們通過(guò)檢測(cè)凋亡蛋白CC3和抗凋亡蛋白Bcl-2。結(jié)果顯示腦出血后CC3蛋白表達(dá)上升，Bcl-2蛋白水平降低，而Nec-1處理后抑制腦出血后CC3的蛋白表達(dá)的上升，而且上調(diào)Bcl-2的表達(dá)量。凋亡作為一種很重要的程序性細(xì)胞死亡方式，已經(jīng)有文章報(bào)道，凋亡發(fā)生于腦出血中[12，13]，部分研究也證明抑制凋亡在腦出血中發(fā)揮保護(hù)性作用[14，15]，說(shuō)明細(xì)胞凋亡現(xiàn)象在腦出血的病理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，Bcl-2蛋白可以促使細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞漿，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16，17]。細(xì)胞內(nèi)雖然存在多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，不同的凋亡信號(hào)的刺激可激活多種caspase，但最終都能導(dǎo)致caspase-3的激活，從而引起細(xì)胞凋亡。結(jié)合以上結(jié)果，提示Nec-1可能通過(guò)抑制凋亡的發(fā)生，而發(fā)揮其對(duì)腦出血的保護(hù)作用。同時(shí)，也說(shuō)明在腦出血損傷中，程序性壞死是不同于凋亡的另一種重要細(xì)胞死亡方式。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在腦出血中，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1可以減少腦出血后腦水腫程度，而且可以提高神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，同時(shí)Nec-1抑制凋亡蛋白CC3的表達(dá)，而增加抗凋亡蛋白Bcl-2。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示Nec-1對(duì)腦出血具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用，多種細(xì)胞死亡方式參與腦出血的損傷機(jī)制中，抗凋亡途徑可能是Nec-1在腦出血中發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一，而且程序性壞死可能存在于凋亡的上游，因此其作為一種重要的細(xì)胞死亡方式，參與腦出血損傷中。程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1具有廣泛的應(yīng)用前景，不僅有助于進(jìn)一步闡明程序性壞死的分子機(jī)制，而且對(duì)于神經(jīng)損傷性疾病新治療策略的發(fā)展都有著極其重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死細(xì)胞死亡途徑，不僅發(fā)生在腦出血中，而且是可以被調(diào)控的。進(jìn)一步我們推測(cè)程序性壞死可能是腦出血細(xì)胞死亡類型中重要方式之一，程序性壞死可能存在于細(xì)胞凋亡的上游，抑制程序性壞死可能成為腦出血防治的重要途徑，抗凋亡有可能成為治療腦出血的一種方法。另一方面，發(fā)展有效的抑制劑不僅有利于研究此信號(hào)途徑的調(diào)控機(jī)制，而且將為腦出血等疾病的治療提供新的方案，還可能將揭示細(xì)胞程序性死亡途徑中新的作用蛋白。更重要的是，化學(xué)抑制劑都是潛在的藥物，進(jìn)一步的機(jī)制研究和改良以及在動(dòng)物疾病模型上的深入探討都有可能幫助其發(fā)展成為臨床藥物，這將為腦出血等疾病提供新的治療手段。

[1]Keep RF，Hua Y，Xi G. Intracerebral haemorrhage：mechanisms of injury and therapeutic targets [J]. Lancet Neurol，2012，11(8)：720-731.

[2]Balami JS，Buchan AM. Complicationsof intracerebral haemorrhage[J]. Lancet Neurol，2012，11(1)：101-118.

[3]Yin B，Xu Y，Wei RL，et al. Inhibition of receptor-interacting protein 3 upregulation and nuclear translocation involved in Necrostatin-1 protection against hippocampal neuronal programmed necrosis induced by ischemia/reperfusion injury[J]. Brain Res，2015，1609：63-71.

[4]Linkermann A，Br?sen JH，Himmerkus N，et al. Rip1 (receptor-interacting protein kinase 1) mediates necroptosis and contributes to renal ischemia/reperfusioninjury[J]. Kidney Int，2012，81(8)：751-761.

[5]Wang YQ，Wang L，Zhang MY，et al. Necrostatin-1 suppresses autophagy and apoptosis in mice traumatic brain injury model[J]. Neurochem Res，2012，37(9)：1849-1858.

[6]Chen S，Yang Q，Chen G，et al. An update on inflammation in the acute phase of intracerebral hemorrhage[J]. Transl Stroke Res，2015，6(1)：4-8.

[7]Linkermann A，Green DR. Necroptosis[J]. N Engl J Med，2014，70(5)：455-465.

[8]Degterev A，Huang Z，Boyce M，et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J]. Nat Chem Biol，2005，1(2)：112-119.

[9]Feoktistova M，Leverkus M. Programmed necrosis and necroptosis signalling[J]. FEBS J，2015，282(1)：19-31.

[10]Adeoye O，Clark JF，Khatri P，et al. Do current animal models of intracerebral hemorrhage mirror the human pathology[J]. Translational Stroke Research，2011，2(1)：17-25.

[11]Keep RF，Zhou N，Xiang J，et al. Vascular disruption and blood-brain barrier dysfunction in intracerebral hemorrhage[J]. Fluids Barriers CNS，2014，10：11-18.

[12]LoPresti MA，Bruce SS，Camacho E，et al. Hematoma volume as the major determinant of outcomes after intracerebral hemorrhage[J]. J Neurol Sci，2014，345(1/2)：3-7.

[13]Chen JC. The effects of acupuncture and traditional Chinese medicines on apoptosis of brain tissue in a rat intracerebral hemorrhage model[J]. Physiol Behav，2015，151：421-425.

[14]Wang T，Huang Y，Zhang M，et al. [Gly14]-Humanin offers neuroprotection through glycogen synthase kinase-3beta inhibition in a mouse model of intracerebral hemorrhage[J]. Behav Brain Res，2013，247：132-139.

[15]Sun H，Tang Y，Li L，et al. Effects of local hypothermia on neuronal cell apoptosis after intracerebral hemorrhage in rats[J]. J Nutr Health Aging，2015，19(3)：291-298.

[16]Serasinghe MN，Missert DJ，Asciolla JJ，et al. Anti-apoptotic BCL-2 proteins govern cellular outcome following B-RAF(V600E) inhibition and can be targeted to reduce resistance[J]. Oncogene，2015，34(7)：857-867.

[17]Chipuk JE. BCL-2 proteins：melanoma lives on the edge [J]. Oncoscience，2015，2(9)：729-730.

The role and mechanism of Nec-1 after intracerebral hemorrhage in mice

CHANG Pan，YU Jun，ZHANG Mingyang，et al.

(Central Laboratory，Second Affiliated Hospital of Xi’an Medical College，Xi’an 710038，China)

Objective To investigate the influence of Nec-1，a specific necroptosis inhibitor，on neurofunction after intracerebral hemorrhage and underlying mechanism. Methods Male ICR mice (25～30g) received an infusion of collagenase type IV to induce ICH (intracerebral hemorrhage) or saline as control into the left striatum. Nec-1 and vehicle were pretreated with a single intracerebroventricular (i. c. v. ) injection into the ipsilateral ventricle 15 min before ICH，respectively. Those mice were randomizes into three groups，control group，ICH and vehicle group，ICH and Nec-1 group. Then brain water content and neurological test were assessed. Meanwhile，the protein of cleaved caspase-3 and Bcl-2 were detected by Western blotting. Results Nec-1-treated group attenuated the brain water content and improved neurological function compared with vehicle group after ICH. Nec-1-treated group inhibited the cleaved caspase-3 and enhanced the Bcl-2 protein expression compared with vehicle group after ICH. Conclusion Nec-1 plays neuroprotection role via inhibition of apoptosis after ICH. Meanwhile，it shows that necroptosis has an important role after ICH，which also provides a new way for treating ICH.

Nec-1； Necroptosis； Intracerebral hemorrhage； Cleaved caspase-3； Bcl-2

1003-2754(2016)03-0196-04

2015-11-20；

2016-02-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81301039)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(No. 152865)；陜西省教育廳專項(xiàng)科研資助項(xiàng)目(No. 15JK1617)；蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No. SYSD2015119)

(1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710038；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)系，江蘇 蘇州 215123；3.第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032；4.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038；5.蘇州市立醫(yī)院北區(qū)婦產(chǎn)科，江蘇 蘇州 215008)

于 軍，E-mail：pclamper@163.com

R743.34

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