CRMP2衍生的ST2-104多肽對阿爾茨海默病大鼠皮質神經元的保護作用

孟盼盼， 張雨晴， 高媛媛， 孫 莉， 李 琦

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CRMP2衍生的ST2-104多肽對阿爾茨海默病大鼠皮質神經元的保護作用

孟盼盼1， 張雨晴1， 高媛媛1， 孫 莉2， 李 琦1

目的 研究ST2-104肽對阿爾茨海默病(AD)大鼠腦皮質內NMDAR1、NMDAR2B、CRMP2、P-CRMP2的表達影響，進而改善大鼠的認知功能，對神經元發揮保護作用。方法 采用單次單側腦室微量注射Aβ25-35片段制備AD大鼠模型，具有相同遺傳背景的Wistar大鼠作為假手術對照組，分別給予不同劑量的ST2-104多肽和鹽酸美金剛治療。Aβ注射2 d后給藥10 d，HE染色法觀察腦皮質部分形態變化，甲醇剛果紅染色法觀察淀粉樣物質沉積情況，WB及免疫組化法檢測大鼠腦皮質組織NMDAR1、NMDAR2B、CRMP2、P-CRMP2的表達。結果 與假手術組相比，模型組淀粉樣物質沉積明顯增多，腦皮質部分NMDAR2B表達顯著增多(P<0.01)，NMDAR1表達相對減少，P-CRMP2與CRMP2表達量均無明顯差異；ST2-104多肽可以逆轉上述現象，降低NMDAR2B表達(與模型組相比，高劑量組P<0.05)，增加NMDAR1表達(與模型組相比，高、低劑量均為P<0.05)。結論 (1)ST2-104可能通過減少NMDAR2B表達降低其活性來發揮對AD大鼠皮質神經元的保護作用。

阿爾茨海默病； ST2-104； Aβ25-35； NMDAR； CRMP2

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關的起病隱匿的漸進性神經退行性疾病，早期神經損傷癥狀是學習和記憶空間認知能力的缺陷[1]。其主要病理學改變是中樞大腦皮質神經元及其突觸減少，Aβ淀粉樣蛋白沉積和神經原纖維纏結形成[2]。目前的治療仍不能有效改善和阻滯AD疾病進展，其發病機制尚不明確。ST2-104多肽是帶有穿膜結構的腦衰蛋白反應調節蛋白2(CRMP2)衍生肽，可通過血腦屏障到達腦組織拮抗CRMP2與相關蛋白結合而發揮作用，在腦創傷及腦缺血相關疾病中發揮積極保護作用[3，4]。本實驗探討ST2-104對Aβ25-35肽致AD大鼠神經元的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠50只，體重180～250 g，吉林大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 ST2-104純度98%，由耀強生物科技有限公司合成；Aβ25-35(A4559-1MG)購于SIGMA；鹽酸美金剛購于丹麥靈北藥廠；NMDAR1(ab52177)、NMDAR2B(ab28373)、CRMP2(ab129082)、P-CRMP2(Ser522)(ab193226)抗體購于abcam；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗IgG(111-035-003)購于Jackson ImmunoResearch；甲醇剛果紅染色試劑盒購于南京森貝咖生物科技有限公司，大鼠腦立體定位儀購于深圳瑞沃德生命科技有限公司；顯微鏡為蔡司1×71。

1.3 實驗分組 50只大鼠適應性喂養1 w后，隨機分為假手術組、AD模型組、ST2-104高劑量組、ST2-104低劑量組、鹽酸美金剛陽性對照組，每組10只。

1.4 動物模型制備及給藥 采用單次單側腦室微量注射Aβ25-35肽法制備阿爾茨海默病大鼠模型。大鼠術前12 h禁食不禁水。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，頭局部去毛，消毒，正中矢狀位切口，剝離骨膜及周邊結蹄組織，定位使前囟點、后囟點、人中縫處在同一水平線上，根據《大鼠腦立體定位圖譜》定位，以前囟點為原點，旁開1.8 mm，后開1.08 mm，牙科鉆顱骨鉆孔，深3.8mm處注射Aβ25-35老化液8 μl(16 μg)，20 min注完，留針10 min，出針5 min，消毒，縫合切口。假手術組注射等體積的生理鹽水。

造模術后2～12 d ST2-104高劑量組(15 mg/kg·d)、ST2-104低劑量組(3 mg/kg·d)大鼠尾靜脈給藥，鹽酸美金剛陽性對照組(3 mg/kg·d)灌胃給藥，模型組與假手術組分別給予等體積的生理鹽水。每2 d稱量大鼠體重調整給藥。

1.5 腦組織病理學及分子生物學檢測

1.5.1 取材 給藥結束后，禁食不禁水12 h處死實驗大鼠。10%水合氯醛麻醉，迅速暴露胸腔，自心尖插入灌流針至主動脈，剪除右心耳，灌注生理鹽水至肺部和肝臟發白，留出液體澄清，4%多聚甲醛灌注至大鼠軀體僵硬。斷頭取腦，固定于4%多聚甲醛溶液24 h以上，石蠟包埋切片。冠狀位連續切片，每片約4 μm。麻醉后的大鼠迅速處死斷頭取腦，剝離海馬、皮質，錫紙包裹凍存于液氮中。

1.5.2 HE染色 石蠟切片常規脫蠟：二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各15 min，100%乙醇(Ⅰ)、100%乙醇(Ⅱ)、95%乙醇各10min，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5min，蒸餾水2 min。蘇木精染色10 min，自來水反藍10 min，伊紅10 s，上行脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.5.3 甲醇剛果紅染色 石蠟切片常規脫蠟，入改良Highman染色液浸染10 min，棄余液；Highman分化夜分化2～5 s，立即入水終止分化，水洗2次；自來水沖洗5 min；入蘇木精1～2 min，自來水洗10 min；上行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.5.4 免疫組織化學染色 石蠟切片常規脫蠟。PBS洗3次，5 min/次；室溫，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶10 min，PBS洗3次，5 min/次；1%胰酶修復抗原，濕盒37 ℃孵育25～30 min，PBS洗3次，5 min/次；5%牛血清白蛋白封閉非特異性抗體，濕盒37 ℃孵育25 min；滴加PBS稀釋的一抗，分別為NMDAR2B(1∶500)、P-CRMP2(1∶200)，4 ℃過夜；回收一抗，PBS洗3次，5 min/次；滴加對應二抗(1∶1000)，濕盒37 ℃孵育45 min，PBS洗3次，5 min/次；DAB避光顯色10～30 min，蒸餾水終止顯色并沖洗；蘇木精復染數秒，上行脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。PBS代替一抗為對照組，其余均相同。

1.5.5 Western Blot 勻漿皮質部分，RIPA裂解液裂解組織提取蛋白，BCA試劑盒蛋白定量，各組處理后蛋白加入Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。配膠，WB上樣、電泳、轉膜、封閉、孵一抗(NMDAR1 1∶1000，CRMP2 1∶10000)、孵二抗(1∶1000)、ECL顯影。

2 結 果

2.1 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質區神經元的影響 與假手術組相比，模型組皮質錐體細胞出現壞死脫落，細胞結構不清晰，核固縮碎裂現象。ST2-104肽給藥組及鹽酸美金剛組大鼠皮質區細胞形態、核染色等與模型組相比均有明顯改善(見圖1)。

2.2 ST2-104肽對AD大鼠皮質區淀粉樣物質的影響 甲醇剛果紅染色法可以特異性的將淀粉樣物質染成深橘紅色。與假手術組相比，模型組大鼠皮質區橘紅色明顯增多且顏色比較深，而ST2-104肽給藥組及鹽酸美金剛組較模型組均有明顯改善且3組間無明顯差別(見圖2)。

2.3 免疫組化結果

2.3.1 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質區NMDAR2B表達的影響 結果顯示，與假手術組相比，模型組NMDAR2B表達明顯增加(P<0.01)，ST2-104高低劑量組表達NMDAR2B量也明顯增加(分別為P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，低劑量組沒有改善NMDAR2B的表達，ST2-104高劑量組NMDAR2B表達量明顯下降(P<0.05)，陽性組表達也存在明顯差異(P<0.01)，高劑量組與陽性組間比較沒有統計學意義(見圖3，見表1)。

2.3.2 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質區P-CRMP2表達的影響 結果顯示，假手術組、模型組、高低劑量組和陽性對照組五組間P-CRMP2表達量均沒有明顯差異(見圖4，見表1)。

2.4 Western Blot結果

2.4.1 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質區NMDAR1表達的影響 結果顯示，與假手術組相比，模型組NMDAR1的表達量有所下降，ST2-104肽給藥組逆轉上述結果，表達NMDAR1明顯增加，并與模型組比較具有統計學意義(P<0.05)(見圖5)。

2.4.2 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質區CRMP2表達的影響 結果顯示，假手術組、模型組、高低劑量組和陽性對照組五組間CRMP2表達量均沒有明顯差異(見圖5)。

圖1 ST2-104肽對AD大鼠皮質區病理形態的影響(HE染色 200×)

圖2 ST2-104肽對AD大鼠皮質區淀粉樣物質沉積的影響(甲醇剛果紅染色 200×)

圖3 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質區NMDAR2B表達的影響

圖4 ST2-104肽對AD大鼠腦皮質區P-CRMP2表達的影響

圖5 ST2-104肽對AD大鼠皮質區NMDAR1、CRMP2表達的影響

組別劑量(mg/kg)nNMDAR2B(OD×10-6)P?CRMP2(OD×10-6)假手術組模型組ST2?104低劑量組ST2?104高劑量組鹽酸美金剛陽性對照組00315310101010104．17±1．009．47±0．57##16．29±1．75##??7．30±1．13#?5．22±0．97??7．07±2．027．21±1．236．66±3．088．00±1．826．41±0．78

與模型組相比*P<0.05，**P<0.01；與假手術組相比#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

阿爾茨海默病是一個與年齡有關的漸進性神經變性疾病。早期神經損傷癥狀是學習和記憶認知能力的缺陷，并逐漸進展[2]。以神經元死亡和突觸聯系減少，Aβ蛋白沉積和神經原纖維纏結為主要病理改變[5]。不同形式的Aβ多肽已經被廣泛用于體內外研究，應用Aβ1-40，1-42或25-35多肽于體外培養的神經元或動物側腦室注射都能模仿出AD模型，結果的可靠性得到公認[6]。Aβ沉積在腦神經元周圍形成AD特有的老年斑，繼而引起興奮性突觸傳遞的軸突和樹突棘密度減少和突觸可塑性降低，LTP(學習與記憶的物質基礎)損害，神經元細胞死亡。本實驗采用單次單側腦室微量注射Aβ25-35多肽制備大鼠阿爾茨海默病模型。術后所有組別大鼠均出現精神不振、行動遲鈍、食量減少等現象，隨著時間延長，假手術組及給藥組大鼠逐漸恢復，無1例死亡；模型組大鼠呆滯萎靡，食欲不振，出現傷亡。HE染色及甲醇剛果紅染色結果表明，ST2-104對AD大鼠皮質區神經結構破壞具有保護作用，可減少淀粉樣物質沉積。

谷氨酸幾乎涉及所有的中樞神經系統功能，是一種快速性興奮性神經遞質；中樞神經系統中70%的興奮性突觸利用谷氨酸作為神經遞質[1，7]。腦組織具有豐富的谷氨酸受體，特別是NMDAR受體，對學習和記憶功能和突觸的可塑性極為重要，通過該受體本身、其共軛離子通道及調節部位形成的復合體而發揮功能，對Ca2+高度通透。文獻報道，Aβ的沉積可直接作用于NMDAR，導致緩慢持續地NMDAR激活，Ca2+通過NMDAR內流進入突觸后神經元，造成細胞內Ca2+過載，引起突觸功能抑制和LTP異常，造成細胞慢性興奮毒性[8，9]和突觸毒性，最終導致細胞死亡，神經功能障礙[10，11]。本實驗中發現，模型組大鼠腦組織中NMDAR2B表達量增加，ST2-104肽給藥后可以逆轉NMDAR2B的增加，高劑量組與模型組具有顯著差異(P<0.05)，可被激活的受體量減少，活性降低，從本質基礎上降低Aβ對神經元的損害。ST2-104可能通過減少皮質區NMDAR2B的表達發揮對皮質神經元的保護作用。實驗中還出現模型組大鼠皮質區NMDAR1表達量稍微減少，而給藥組的表達明顯抬高現象，相關情況報道并不多見，其相關機制需要進一步探索。

CRMP2即塌陷反應介導蛋白，在中樞神經系統特別是海馬區廣泛表達。對于神經的生長發育十分重要，具有促進神經元纖維生長，指導軸突延長，調節生長錐生長和微管的集裝，細胞膜受體內質化等廣泛的生物學調節作用[12]。研究顯示磷酸化的CRMP2可與NMDAR2B結合，最終導致細胞死亡[13，14]。ST2-104肽為CRMP2的衍生肽，可通過血腦屏障，Tatiana等研究表明ST2-104促進CRMP2與NMDAR2B解離使CRMP2內質化降低NMDAR2B的活性而不改變其分布[15]。本實驗結果證實AD腦皮質區CRMP2表達量各組間無明顯變化，ST2-104作用機制可能與上述途徑相似，有待進一步探究。ST2-104肽對AD大鼠皮質神經元具有保護作用，可能通過減少NMDAR2B表達，降低其活性來發揮作用的。

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The protective effects of ST2-104 peptide derived from CRMP2 on cortical neurons in Alzheimer rats

MENG Panpan，ZHANG Yuqing，GAO Yuanyuan，et al.

(Department of Pharmacology，Basic Medical College of Jinlin University，Changchun 130021，China)

Objective To explore the effect of ST2-104 peptide on the expression of NMDAR1，NMDAR2B，CRMP2 and P-CRMP2 in pallium，to elucidate mechanism of ST2-104 on improving the cognitive function following Alzheimer rats. Methods Single single intracerebroventricular microinjection of Aβ25-35 was used to establish the model of Alzheimer and Wistar rats were used as the sham group. Then they were given different dose of ST2-104 or memantine. Administration for 10 days after 2 days injection. The change of pallium cells in cortex region was observed by HE staining. Amyloid deposition was observed by ameliorated Highman Congo red staining. Relative NMDAR1，NMDAR2B，CRMP2，P-CRMP2’s expression were performed by immunohistochemistry and western blot. Results TThere were more amyloid deposition，more NMDAR2B expression(P<0.01)，less NMDAR1 expression in the model group compared with sham group，but there was no markedly differences between P-CRMP2 and CRMP2’s expression. ST2-104 peptide could reverse this phenomenon by decreasing the expression of NMDAR2B(high-dose group，P<0.05)and increasing the expression of NMDAR1 expression(low-dose group and high-dose group，P<0.05)compared with the model group. Conclusion ST2-104 peptide might protect neurons from A-beta toxicity by inhibiting the expression of NMDAR2B and decreasing its activity.

AD； ST2-104； Aβ25-35； NMDAR； CRMP2

1003-2754(2016)03-0203-04

2016-01-05；

2016-03-06

吉林省人才開發資金資助項目(No. 802150021426)，國家自然科學基金(No. 81571231)

(1.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春 130021；2.吉林大學白求恩第一醫院神經內科，吉林 長春 130021)

李 琦，E-mail：youjun08@hotmail.com

R749.1+6

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