SH-SY5Y 神經細胞中α7神經型尼古丁受體基因沉默對CaM、CaMKⅡ蛋白水平的影響

張淑麗， 官志忠，2， 肖 雁， 吳昌學， 齊曉嵐

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SH-SY5Y 神經細胞中α7神經型尼古丁受體基因沉默對CaM、CaMKⅡ蛋白水平的影響

張淑麗1， 官志忠1，2， 肖 雁1， 吳昌學1， 齊曉嵐1

目的 構建穩定的α7 nAChR沉默的神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)細胞，研究α7 神經型尼古丁受體(nAChR)基因沉默對鈣調蛋白(CaM)、鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)水平的影響，了解α7 nAChR神經保護作用及其與阿爾茨海默病(AD)發病機制的關系。方法 將α7 nAChR shRNA重組質轉染到SH-SY5Y，用含嘌呤霉素的培養液篩選，挑選陽性克隆后采用實時熒光定量PCR和蛋白質印跡方法(Western-blot)檢測細胞中α7 nAChR mRNA 及蛋白表達水平的變化；Western-blot方法測定CaM、CaMKⅡ蛋白表達水平。結果 獲得穩定轉染α7 nAChR shRNA重組質粒的細胞克隆株，與對照組相比，α7 nAChR mRNA 及蛋白表達量分別減少了95%和80%。CaM、CaMKⅡ蛋白表達量分別減少了48.5%和35%。結論 成功構建了α7 nAChR mRNA沉默的SH-SY5Y細胞細胞株，α7 nAChR沉默降低了CaM、CaMKⅡ的蛋白水平，可能影響信號通路轉導，這可能與阿爾茨海默病 (AD) 的發病有一定的關系。

RNA干擾； α7神經型尼古丁受體； CaM； CaMKⅡ； SH-SY5Y 細胞

阿爾茨海默病(AD) 是一種老年人最常見的中樞神經系統退行性疾病，從中年期到晚年期緩慢發生的記憶損傷和認知功能障礙[1，2]。膽堿能系統功能障礙是早期AD較突出的基本特征，在AD發生中具有顯著作用[3]。神經型尼古丁受體又稱煙堿乙酰膽堿受體(Neuronal acetylcholine receptors，nAChR)對大腦智力發育、學習記憶和識別能力等功能有重要作用，并參與其他受體許多功能的調節，具有明顯神經保護作用[4]。報道指出在AD患者中觀察到膽堿能損傷與 α7 nAChR水平下降有關[5]。α7nAChR屬于離子通道受體，對Ca2+具有良好通透性，與α7nAChR有關的很多病理及生理機制都涉及到Ca2+內流[6]。大量神經系統疾病患者尸檢中都有關于Ca2+沉積的報告[7]，這引起了人們關注Ca2+在這些疾病中的調節作用。Gu[7]報道在阿爾茨海默病中鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)含量減少，且CaMKⅡ是鈣調蛋白(CaM)的作用底物。本研究用體外合成的shRNA抑制細胞 α7 nAChR的表達，研究其受抑制后CaM、CaMKⅡ表達水平，從而探討 α7 nAChR對CaM、CaMKⅡ 表達水平的影響及研究 α7 nAChR神經保護作用機制及其在AD發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗保存的人腦神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞株；DMEM 高糖培養基、胰酶、雙抗購于 HyClone 公司；OPTI-MEM培養基、血清購于Gbico；由上海生工生物工程技術服務有限公司合成各模板引物序列；Genopure Plasmid Midi Kit、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購于 Roche 公司(德國)；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒購于 invitrogen 公司(美國)；兔抗CaM(FL-149)：sc-5537多克隆抗體、鼠抗CaMKⅡα(A-1)：sc-13141單克隆抗體、鼠抗 -actin單克隆抗體：sc-81178及HRP標記的抗鼠二抗：sc-2005、Control shRNA Plasmid-B、AChR 7 shRNA Plasmid(h)、GFP shRNA Plasmid購自 Santa Cruz Biotechnology Inc (美國)；兔抗 7多克隆抗體購自Genetex(美國)；辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的抗兔二抗#7074購自CST(美國)；聚乙烯二氟膜、ECL-Plus 發光液、膠片購自 Amersham 公司；Real time RT-PCR 所用試劑均購于Roche公司；二甲亞砜(DMSO)購自 Gibco 公司；普通化學試劑均購自 Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的高糖DMEM培養基于5% CO2、37 ℃恒溫中培養SH-SY5Y貼壁細胞。生長良好的細胞用0.25%胰酶蛋白酶消化接種至六孔板，待其匯合度達到70%～80%時，在試劑說明書指導下進行shGFP熒光質控摸索最佳沉默效率，再分別將不同重組質粒轉入培養的SH-SY5Y細胞中。于OPTI-MEM培養基中轉染6 h換10%血清的DMEM培養基，培養24 h之后，加0.004 g/L嘌呤霉素培養液篩選，直至出現單克隆細胞。96孔板有限稀釋，挑取陽性單克隆并擴增培養。收集其細胞，測定α7nAChR mRNA及蛋白表達水平。

1.2.2 細胞α7 nAChR 基因沉默效果測定 采用一步法提取總 RNA，以PCR 循環逆轉錄合成的cDNA為模板進行Real- time PCR。所用試劑為Firststart Universal SYBR Green Master(Rox)。引物序列參照王凡等[8](見表1)。

1.2.3 蛋白表達水平測定 收集細胞，提取細胞蛋白(冰上裂解2 h，14000 r/min離心5 min)并進行BCA方法定量，Western blot方法檢測α7 nAChR、CaM、CaMKⅡ蛋白表達水平，以β-actin為內對照。ImageJ軟件分析結果，計算α7 nAChR、CaM、CaMKⅡ蛋白條帶與β-actin蛋白像素灰度的比值作為蛋白表達相對水平。實驗重復3次，每次3個復孔。

表1 熒光定量PCR引物序列及產物片段

在ABI Step One Plus型實時熒光定量PCR儀，采集α7 nAChR及β-actin基因擴增各循環的熒光信號，以SDS2.1軟件收集熒光和分析數據。分析結果時以β-actin為內對照，計算α7 nAChR基因在實驗組與對照組的相對水平(RQ=2-△△Ct)。實驗重復3次，每次3個復孔。

2 結 果

2.1 免疫熒光方法測沉默效率優化轉染條件 轉染GFP shRNA Plasmid 24 h之后用免疫熒光方法，紫光激發紅光進行倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光標記率。根據熒光值得到在轉染試劑：質粒=3∶1，復合物的最適體積為200 μl(六孔板)，其最適孵育條件為常溫、15 min(見圖1)。

圖1 未轉染shGFP免疫熒光圖(A)；轉染shGFP的最優條件免疫熒光圖(B)×100

2.2 轉染7尼古丁受體基因后7尼古丁受體 mRNA 及蛋白表達水平 本實驗表明，用Real-time PCR和Western blot方法檢測到SH-SY5Y細胞轉染nAChRα7 shRNA質粒后mRNA 及蛋白表達水平分別減少了95%(見圖2A)及80%(見圖2B)，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.01)。而轉染陰性對照與對照組相比不具有差異性。說明已將shα7nAChR成功轉入SH-SY5Y細胞，且抑制了α7 nAChR mRNA和蛋白表達水平。

與對照組相比差異有高度統計學意義**P<0.01

圖2 轉染α7 nAChR shRNA質粒后α7 nAChR mRNA(A)及蛋白表達水平(B)

2.3 轉染7尼古丁受體基因后CaM、CaMKⅡ蛋白表達水平 轉染α7 nAChR shRNA質粒后CaM、CaMKⅡ蛋白表達水平分別減少了48.5%(見圖3)和35%(見圖4)，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.01)。而轉染陰性對照與對照組相比不具有差異性。說明降低α7 nAChR水平能減少CaM、CaMKⅡ蛋白表達水平。

3 討 論

nAChR是神經系統中一類非第2信使介導性神經遞質結合的離子通道，由2種亞單位α和β構成。不同的亞單位以不同的組合構成不同的尼古丁受體亞型(五聚體)，主要調控細胞內外Na+、K+和Ca2+等離子的流動[9]，其含量減少與AD的發病有關[10]。α7nAChR是其中較為特殊的亞型，其在海馬和皮質神經元中高表達[11]，激活的α7nAChR可以調節神經元興奮性和神經遞質釋放[12，13]、改變突觸可塑性[14]、幫助神經元抵御內外因素的損傷，維持正常的生理功能，對維持記憶及認知功能的十分重要。且最近有研究表明在老化過程中α7nAChRs對維持認知功能、學習和記憶具有重要性及α7nAChRs對海馬突觸可塑性的重要性[15]。研究表明，α7nAChR對改善阿爾茨海默病和精神分裂癥患者的認知障礙有顯著作用[16，17]。本研究將針對α7nAChR的shRNA片段轉染到SH-SY5Y細胞中，mRNA和蛋白表達水平明顯下降了。表明α7nAChR shRNA能有效地抑制內源性α7nAChR的表達。

與對照組相比差異有統計學意義**P<0.01；與陰性對照組相比差異有統計學意義##P<0.01

圖3 轉染α7 nAChR shRNA質粒后CaM蛋白表達水平

與對照組相比差異有統計學意義**P<0.01；與陰性對照組相比差異有統計學意義#P<0.05

圖4 轉染α7 nAChR shRNA質粒后CaMKⅡ蛋白表達水平

配體門控型離子通道的α7nAChR對Ca2+通透性極強，對維持細胞內鈣穩態具有重要的作用[18]。Ca2+流入神經細胞內與CaM相結合，進一步激活下游的涉及長時程增強 (LTP) 維持的級聯反應[19]。鈣調蛋白CaM在細胞中是重要的多功能蛋白，激活40多種酶或通道。它不僅參與了神經元和星形膠質細胞的信號級聯放大系統，及參與突觸可塑性、細胞分化與增生，而且還在LTP和學習記憶中起著非常重要的作用[20]。CaMKⅡ是由α、β、γ、δ4種亞基單位組成的異質多聚體，并分別有四種不同的基因編碼[21]，是一種多功能的蛋白激酶，通過磷酸化許多底物蛋白來傳導Ca2+信號，在神經遞質的合成和釋放、LTP以及突觸的可塑性、學習記憶中起著重要作用。CaMKIIa基因敲除小鼠LTP及空間記憶能力均受損[22]。因此，CaMKⅡ可能是學習和記憶的分子基礎，CaMKⅡ活性異常可能是阿爾茨海默病的發病機制之一。

本研究旨在構建重組α7 nAChR shRNA沉默質粒并表達在SH-SY5Y細胞內，觀察其對神經細胞的影響。本研究成功構建的α7 nAChR shRNA真核表達載體有效地抑制了 SH-SY5Y 細胞中 α7 nAChR 的表達，為進一步的研究是否通過α7 nAChR表達減少而影響CaM、CaMKⅡ蛋白表達水平。α7 nAChR表達水平下降這可能是配體門控型離子通道的α7nAChR數目減少進而使進入細胞的Ca2+減少，導致CaM蛋白表達也減少，進而導致Ca2+/CaM復合體減少，進一步導致下游級聯反應，CaMKⅡ表達也減少，阻斷LTP的產生，最終可能導致學習記憶能力障礙，促使AD的發生與發展。我們前期研究表明，抑制了 SH-SY5Y 細胞中 α7 nAChR 的表達能使Aβ生成增多，但AD中CaM、CaMKII變化與Aβ相互聯系還有待于進一步的研究。這提示α7 nAChR對AD可能具有重要的神經保護作用。

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Influence of α7 neural nicotinic receptor gene silencing on the protein levels of CaM and CaMK Ⅱin SH-SY5Y cells

ZHANG Shuli，GUAN Zhizhong，XIAO Yan，et al.

(The Key Laboratory of Molecular Biology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China)

Objective Investigating that the influence of inhibited gene expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) induced by RNA interference on the protein levels of calmodulin (CaM) and calmodulin dependent protein kinase Ⅱ(CaMK Ⅱ)，and to understand the neuroprotective mechanism of α7 nAChR and its function in the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Method The recombinant α7 nAChR shRNA were transfected into SH-SY5Ycells，the stable clones were screened with puromycin，and used Real-time PCR and Western blot monitoring the levels of α7 nAChR mRNA and protein，respectively. The protein levels of the CaM and CaMK Ⅱ were also determined by Western blot. Results We got the cell clone strains with stable transfection of α7 nAChR shRNA recombinant plasmid，and as compared with controls，the expression levels of α7 nAChR mRNA and protein in such cells were decreased by the inhibitory efficiency with 95% and 80%，respectively. The protein levels of CaM and CaMK Ⅱ were decreased by 48.5% and 35% respectively. Conclusion The results indicated that the inhibited gene expression of α7 nAChR could decrease the level of CaM，CaMK Ⅱ，which may affect the signal transduction pathway，suggesting that α7 nAChR may play a crucial neuroprotective role in Alzheimer disease’s pathogenesis.

RNA interference； α7 nAChR； CaM； CaMKⅡ； SH-SY5Y Cell

1003-2754(2016)03-0207-04

2015-11-10；

2016- 01-20

國家自然科學基金資助項目(81360178)，教育部“長江學者和創新團隊發展計劃資助”(IRT13058)，貴州省科技廳重大專項(黔科合重大專項字2014[6008])，貴州省科技廳項目(201344，黔科合SY字[2013]3020)

(1.貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學病理學教研室，貴州 貴陽 550004)

齊曉嵐，E-mail：xiaolan76@163.com

Q51；R749.1*6

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