突觸體制備方法研究

周榮易， 王嬌嬌綜述， 韓新民審校

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突觸體制備方法研究

周榮易， 王嬌嬌綜述， 韓新民審校

突觸(synapse)，即是指一個神經元與另一個神經元相接觸的部位，突觸是神經元之間在功能上發生聯系的部位，也是信息傳遞的關鍵部位。由于其特殊位置和作用，突觸是探討腦功能的關鍵所在[1]。在現代神經生物學及眾多其他學科的研究中，突觸的作用日益得到重視。從中樞神經系統中分離出形態完整，活性較高的突觸體是進行離體神經生理、生化和藥理研究的前提。但國內相關制備技術卻鮮有報道。國外突觸體制備技術從發明至今已從最初的不連續性蔗糖密度梯度法發展到隨后的改進方法及Ficoll/sucrose法直至現在的不連續性Percoll密度梯度離心法，其方法不斷改進，技術不斷革新，為現代神經生物學研究提供了保障。通過查閱搜集大量國內外相關文獻，總結國外突觸體制備技術，介紹國外突觸體制備技術的發展和先進技術的應用，以備參考。

1 突觸體

突觸體(synaptosome)，這一專有名稱最早是于1964年由Whittaker和他的團隊提出，并被他們通過離心方法提取出來[2]。突觸體是指具有突觸區完整形態結構的封閉顆粒，實際上它是斷裂脫落的神經末梢或突觸連接區，從某種意義上講，它可以被認為是一個具有功能完整的活細胞[3]，突觸體之所以能被離體制備，根本在于其突觸間連接的牢固性和突觸裂口區的自動融合性，這些特性能夠使斷裂的神經末梢完整保存突觸區的各種成分及其功能，保留著活細胞的一系列特性[3]。這就使得突觸體的分離和離體實驗變得可能且具有研究價值。自20世紀60年代突觸體分離成功，突觸體分離技術促進了神經生物學的快速發展，離體突觸生理、生化及藥理研究等大大促進了人們對神經系統疾病的認知。研究報道，海馬神經元突觸體的損傷與數量的減少與老年人的記憶力減退密切相關[4，5]。另有相關報道證實突觸體的受損與減少同樣會導致小鼠的學習能力和記憶能力下降[6]。因此，制備結構完整、高活性的突觸體是進行神經生物學研究的前提。

2 制備方法

從20世紀60年代突觸體分離成功至今，突觸體的分離和純化方法得到了不斷的改進，所提取的突觸體形態結構保存不斷完整；生理活性不斷提高；同時，隨著方法的不斷完善和革新，提取率也有所上升。突觸體為生物化學和藥理學對神經末梢的研究和神經遞質傳導體外研究提供了良好的研究對象[7]。現代神經生物學研究中，制備形態結構完整、具有生理活性和較高產出率的突觸體，是進行神經生物學進一步分析研究的基礎。從突觸體命名至今，突觸體的制備與純化和其他亞細胞結構的提取和純化方法大致相同，主要可分為不連續性蔗糖密度梯度離心法(蔗糖法)[2，8]、經典方法的改進型方法[9]、和不連續性Percoll 密度梯度離心法[10]3種。

2.1 不連續性蔗糖密度梯度離心法 不連續性蔗糖密度梯度離心法，其基本原理是利用蔗糖或蔗聚糖等小分子溶液，根據所離心的組織勻漿液的不同分子量，預先配制好不連續性濃度梯度，根據不同分子量組織在離心力和重力作用下的通透性和沉降速率不同，將勻漿液等置于梯度液頂層離心，在離心力和重力作用下，不同分子量的組織會在梯度液中分層分離，根據已知所需組織的生物學特點，判斷其分層位置后取出進行相關研究。該方法于上世紀60年代最先由Whittaker等人運用，被奉為突觸體制備的經典方法，至今仍然在許多組織提取和純化實驗中運用，運用領域十分廣泛。其大致操作流程如圖1所示：

圖1 經典方法制備突觸體[2，8]

1996年中國臺灣學者Tong等[7]為研究泌尿系統膀胱的神經生理學和神經藥理學作用，運用該方法嘗試從膀胱組織中提取突觸體并獲得成功，簡要操作步驟如下：(1)3月齡大的Wistar 大鼠，斷頭處死，沿腹白線快速取出膀胱；(2)迅速稱重，用剪刀將膀胱剪為長度為2～5 mm的碎片；(3)將碎片置于含有濃度3 mmol/L，pH值為7.2的鈉磷酸鹽的0.32 mol/L的蔗糖液中勻漿；實驗所有操作均在4 ℃條件下進行；(4)勻漿液1000 r/min離心10min；(5)將所得顆粒物質按上一步驟再次離心；(6)將離心后漂浮物收集17000 r/min離心20 min；(7)將顆粒物放入1.5 ml的0.32 mol/L的蔗糖液再懸浮并低速短暫離心；(8)按照Gray and Whittaker[8]的蔗糖梯度離心法將顆粒物置于梯度液；(9)梯度液超高速離心機100000 r/min離心60 min；(10)取位于0.8～1.2 M梯度帶上的微粒物質，用標準液5倍稀釋并低溫離心機5000 r/min離心30 min，將微粒物置于1 ml的標準液中再懸浮，配方如下：NaCI 132 mmol/L，KCI 5 mmol/L，CaCl21.2 mmol/L，MgCI21.3 mmol/L，NaH2PO41.2 mmol/L，glucose 10 mmol/L，Tris-base 20 mmol/L；調pH至7.4，置于室溫環境。該方法作為經典的提取方法，應用范圍廣泛，可以對中樞神經系統和外周神經系統的神經末梢進行提取和純化，在被報道后的幾十年間受到國內外學者的廣泛重視和應用。

2.2 改進型方法 經典的蔗糖梯度離心法應用廣泛，為突觸體制備和研究做出了巨大貢獻。但同時也存在制備時間長，高速離心次數過多和時間過長，無法保證突觸體結構完整性等不足。最初階段，為了提高效率，對于需要突觸體進行遞質分析的工作，多數學者直接運用P2部分(P2部分相當于離心后粗制線粒體部分，包含突觸體、線粒體和細胞膜等)進行。但P2部分含有線粒體和溶酶體等相關的酶類，不同程度地干擾了遞質分泌和代謝進程[1]。為了糾正這些缺點，學者在運用過程中不斷進行改進以縮短制備時間，提高突觸體純度。1978年，有學者運用Ficoll/sucrose[9]方法制備突觸體。作為一種制備方法，該方法和經典方法在原理和操作上有諸多相同，在此不做贅述。在突觸體中，突觸前神經末梢在結構上是比較牢固的，在勻漿時，神經元破碎而突觸區仍可保留完整性。將組織放入等滲介質中勻漿，再用差速離心法分離勻漿液中各亞細胞結構組分。紋狀體在調控大腦對行為能力和其他重要的認知能力方面具有重要作用，它主要接收來自大腦黑質區、丘腦區和大腦皮質的信息并加以處理，丘腦區和腦皮質主要傳輸興奮性的信息，這一作用可能與谷氨酸受體有關，為了研究證實突觸前膜促代謝性谷氨酸受體(mGlu receptor)激活調控谷氨酸的釋放，1995年，國外學者East等[11]在前人方法基礎上運用了如下方法制備突觸體，具體步驟如下圖2：

圖2 突觸體提取步驟[11]

East等人的方法是在密度梯度離心法的基礎上根據自身實驗室的條件和經驗總結而來，采用差速離心法，部分改進了經典方法，降低了實驗難度，提高了制備效率。1997年，日本學者[12]在NO抑制腦內突觸體對5-HT的吸收作用的研究中，研究人員運用差異離心法制備突觸體觀察突觸體與5-HT在不同劑量NO作用下的關系變化，他們所用的突觸體的制備方法和該方法大致相同，也是根據自身經驗在此基礎上進行簡單修改，可供參考。

2.3 不連續性Percoll 密度梯度離心法 Percoll 是一種含有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20 mosm/kg H2O)，粘度也很小，可形成高達1.3 g/ml密度，采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(200～1000 r/min)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于 Percoll 擴散常數低，所形成的梯度十分穩定。此外，Percoll不穿透生物膜，對細胞無毒害，因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒，還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。經典的蔗糖密度梯度離心法和在運用過程中的相關改進方法，均可以制備出突觸體，但有諸多的不足。近年來，隨著Percoll試劑的廣泛運用和推廣，不連續性Percoll 密度梯度離心法制備突觸體技術日趨成熟，其制備的突觸體以其諸多優勢被國外學者所采用。2008年，Nature Protocols雜志對該方法進行詳細報道[13]，并對該方法的優勢及詳細步驟進行介紹。這更使得該方法在國外突觸體制備技術上逐漸占據主導和領先地位。該方法自80年代被Nagy等人[10]報道以來，運用范圍不斷擴大，并不斷改進而趨于成熟。如Bai and Witzmann[14]；Whittaker[15]，Hajos[16]等都運用Percoll密度梯度離心法成功制得符合研究要求的突觸體。根據2008年Nature Protocols雜志對該方法的詳細報道，具體實驗步驟如圖3：

圖3 不連續性Percoll密度梯度離心法[13]

除此之外，近幾年不斷有人在此方法的基礎上進行改進和完善，使得該方法更加高效便捷。2011年，Westmark等人[17]根據自己的制備經驗，對該方法進行改進優化，使得突觸體的制備更加簡便。為節約實驗時間和人力，制備出更高質量的突觸體，2014年Murphy等人[18]發明了高通量、半自動化的制備儀器(eg. FastPrep Tissue and Cell Homogenizer，MP Biomedical，Santa Ana，CA，USA，#116004500，et al. )來提高突觸體制備的效率。根據他們的報道，運用這一設備，他們的制備時間降至約35 min，這和傳統方法的4～5 h相比，大大節省了研究人員的實驗時間和勞動量，為突觸體的制備提供了嶄新的途徑，這一技術可能使突觸體的制備和神經生物學研究邁入快車道。

3 討 論

突觸體作為一個可被看作是具有完整結構和功能的活細胞的脫落神經末梢，它的成功制備是能夠進行體外神經生理、神經病理和神經遞質分泌等相關研究的前提。制備結構完整、具有活性的突觸體，既是完成實驗研究的必然要求，也應該是從事神經生物學和神經系統疾病實驗研究人員的必備技能。在國內，目前這一工作的開展還不普及，制約了相關學科實驗研究的發展。雖然不連續性蔗糖密度梯度離心法在國內有部分實驗室應用比較成熟[19，20]，但該技術相對比較落后，存在制備時間較長、突觸體完整性較差、梯度液易混淆等不足。隨著實驗研究的不斷進步，經典方法得到不斷改進以彌補該方法的不足。East等人在經典方法基礎上的改進方法操作流程簡單，不需要配制密度梯度液，部分糾正了經典方法的不足。但該法制備的突觸體純度和產出率較低，其活性有待檢測，對于一般的突觸體分析比較適宜，而對要求較高的神經分子生物學研究則需進一步純化。不連續性Percoll密度梯度離心法作為一種新方法，2008年，Nature Protocols[13]完整介紹了Percoll密度梯度離心法并總結了該方法的優缺點。Percoll梯度液的優點：(1)目前最快速的制備有活性的突觸體的方法。(2)全程是在等滲條件下進行，對突觸體有很好保護性。(3)不需超高速離心，最大限度保證突觸體結構完整性。(4)制備的突觸體具有較高活性。(5)花費時間較少，所制得突觸體運用范圍廣泛。存在的不足：(1)高純度的突觸體產出率相對較低，主要集中在第4梯度帶，但對于大多數實驗可以將3～4梯度帶一同收集。(2)Percoll梯度液配制較費時，但該梯度液可以在實驗前不超過24 h內提前配制備用。(3)該方法對離心機有特殊要求等。該方法作為目前較先進的制備方法在國外應用越發廣泛，其諸多優勢可填補經典方法的不足，但國內對關于這一技術制備突觸體的有關文獻僅有兩篇[21，22]，且實驗路線介紹比較簡略。此外，國內實驗室對突觸體制備技術的報道文獻很少且大都限于經典技術路線，這大大制約了國內相關方面的研究進程。顯而易見，突觸體的制備是一項十分有意義且要求相對較高的技術，它能將神經生物學的研究帶入離體實驗階段，從微觀上進行深入分析。同時，在此離體研究的基礎上，若能和整體研究相結合，必然能促進神經生理、神經病理、神經生物學的研究。相信隨著國內研究工作的深入發展，突觸體的制備技術必然會被眾多學科重視運用，為國內神經生物學的研究做出貢獻。

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1003-2754(2016)03-0280-03

Q421；R338.1+3

2015-01-30；

2016-02-28

國家自然科學基金資助項目(No. 81273801)

(南京中醫藥大學中醫兒科學研究所，江蘇 南京 210023)

韓新民，E-mail：hxm1nj@163.com

綜 述