脫氫表雄酮對人臍靜脈內皮細胞血管舒張功能的影響*

夏尊恩 周 泉 李 艷

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脫氫表雄酮對人臍靜脈內皮細胞血管舒張功能的影響*

夏尊恩 周 泉 李 艷#

目的：分析脫氫表雄酮(DHEA)對CD40L刺激的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的一氧化氮(NO)、內皮素-1(ET-1)水平及ET-1 mRNA和內皮源性NO合酶(eNOS)mRNA表達水平的影響，探討DHEA對血管舒張的作用。方法：原代培養HUVECs，給予CD40L(1μg/m1)刺激(CD40L刺激組)和不同濃度DHEA(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L，分別為低、中、高濃度DHEA組)干預，以不作干預的培養細胞為空白對照組。采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測HUVECs的ET-1、eNOS mRNA表達，采用ELISA和硝酸還原酶法分別檢測細胞培養液中NO和ET-1濃度。結果：與空白對照組比較，CD40L刺激組ET-1 mRNA和ET-1濃度明顯增加，eNOS mRNA和NO水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與CD40L組比較，不同濃度DHEA組ET-1 mRNA和ET-1水平降低，eNOS mRNA和NO水平增加，以高濃度DHEA組變化最明顯(P<0.05或P<0.01)。結論：DHEA能通過抑制ET-1表達和促進NO生成來保護內皮細胞的舒張血管功能。

脫氫表雄酮；人臍靜脈內皮細胞；一氧化氮；內皮素-1；舒張功能

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴重危害人類健康的一種常見血管病，目前已經認識到內皮細胞功能失調是導致AS形成的重要因素[1]。血管內皮不僅具有屏障功能，更重要的是它還具有內分泌、信息傳遞、血小板調節和抗黏附等功能。正常狀態下，血管內皮會分泌一氧化氮(NO)、內皮素-1(ET-1)、內皮源性NO合酶(Endothelial Nitric Oxide

Synthase，eNOS)、前列環素、白細胞介素6(IL-6)等血管活性因子，調節血管舒張、收縮、炎癥反應、血管平滑肌細胞增殖、血小板聚集、白細胞黏附等[2]。流行病學及動物實驗資料顯示脫氫表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)作為一種雄激素，對心血管系統有保護作用[3-5]。目前有研究發現，雄激素可使男性冠心病患者肱動脈擴張，而這些血管擴張作用主要依賴于血管內皮舒張功能[6]。因此，本文通過體外培養人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)，觀察DHEA對其表達NO、ET-1、eNOS的作用，探討DHEA對血管內皮舒張/收縮功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

內皮細胞ECM培養基購自美國Sciencell公司；DHEA、1型膠原酶購自美國Sigma公司；Trizol 購自美國Invitrogen公司(批號15596-028)；反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑購自立陶宛Fermentas公司(批號1175936)，引物由上海生工生物技術有限公司合成；NO檢測試劑盒購自南京建成生物醫學工程研究所(批號20120430)；ET-1檢測試劑盒購自美國Assay Designs Inc公司(批號K863502)。實驗所用臍帶采自本院產科健康新生兒，產婦及家屬知情同意，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：無菌條件下取健康新生兒臍帶，采用膠原酶消化法從臍靜脈血管內皮將內皮細胞洗脫下來后進行原代培養，待細胞融合長滿形成單層細胞后，用0.25%胰蛋白酶消化及傳代培養，內皮細胞鑒定采用Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色，呈典型鋪路石樣排列。實驗前24h將培養基改為無血清培養基，實驗選用生長狀態良好的對數生長期細胞。實驗共分為5組：(1)空白對照組(無干預)；(2) CD40L刺激組[7](1μg/m1 CD40L與內皮細胞共同培養24h)；(3)低濃度DHEA(10-8mol/L)組；(4)中濃度DHEA(10-7mol/L)組；(5)高濃度DHEA(10-6mol/L)組。每組設3個復孔。3-5組先給予不同濃度的DHEA 干預1h，再加入1μg/ml CD40L與內皮細胞共同培養24h。

1.2.2 RT-PCR檢測mRNA表達：用TRIzol試劑提取HUVECs總RNA，將總RNA逆轉錄成cDNA，然后進行 PCR擴增。ET-1上游引物：5’-TAC TTC CCA CAA AGA CCA CA-3’，下游引物：5’-CGG ACA GAT GTT CTT GCT AA-3’，擴增產物長度為356bp。eNOS上游引物：5’-GAG TCC TCA CCG CCT TCT C-3’，下游引物：5’-AGG AAG CGC GTG GCA GTA-3’，擴增產物長度為664bp。GAPDH上游引物：5’-ACG GAT TTG GTC GTA TTG GG-3’，下游引物：5’-TCC TGG AAG ATG GTG ATG GG-3’，擴增產物長度為211bp。PCR條件為：94℃預變性2min，進入循環，94℃變性60s，ET-1：54℃，GAPDH：56℃，eNOS：54℃，退火60s，72℃延伸60s的條件下循環擴增。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像分析系統進行圖像分析，測定PCR產物條帶的光密度(A)值。以GAPDH作內參照，ET-1和eNOS條帶的A值分別與GAPDH的A值的比值表示其相對表達水平。

1.2.3 ET-1濃度測定：采用ELISA雙抗體夾心法。嚴格按照試劑盒說明書方法操作，在酶標儀450nm處，以空白對照孔調零后測各孔A值，根據標準曲線計算各組樣品ET-1濃度。

1.2.4 NO濃度測定：采用硝酸還原酶法。分別取雙蒸水、標準品和各組培養細胞上清液各100μl，按照NO檢測試劑盒方法操作，在酶標儀上測定550nm處A值，根據標準品A值計算各組樣品NO含量。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 DHEA對ET-1 mRNA表達的影響

相對定量分析顯示，各組ET-1 mRNA表達差異有統計學意義(F=13.18，P<0.01)。CD40L刺激組ET-1 mRNA表達較空白對照組明顯增加(1.16±0.21 vs 0.23±0.05，t=10.63，P<0.01)；不同濃度DHEA組ET-1 mRNA表達均較CD40L刺激組下降，高濃度DHEA組下降最多(0.46±0.12，t=8.49，P<0.05)。見圖1。

2.2 DHEA對ET-1濃度的影響

各組ET-1濃度差異有統計學意義(F=15.56，P<0.01)。與空白對照組比較，CD40L刺激組ET-1水平明顯上升(46.15±5.07μg/L vs 75.39±6.51μg/L，t=4.96，P<0.05)，不同濃度DHEA 組ET-1濃度均較CD40L刺激組下降，高濃度DHEA組下降最多(46.68±5.24μg/L，t=6.71，P<0.05)。見圖2。

注：與空白對照組比較，* P<0.01；與CD40L刺激組比較，

注：與空白對照組比較，* P<0.05；與CD40L刺激組比較，

2.3 DHEA對eNOS mRNA表達的影響

各組間eNOS mRNA表達差異有統計學意義(F=21.39，P<0.01)。與空白對照組比較，CD40L刺激組eNOS mRNA表達降低(0.20±0.05 vs 0.11±0.03，t=6.38，P<0.01)。與CD40L刺激組比較，不同濃度DHEA組eNOS mRNA表達顯著增加，相對定量值分別為0.21±0.06、0.33±0.09、0.52±0.11(t=7.02、8.54、10.36，P<0.05或P<0.01)。見圖3。

注：與空白對照組比較，* P<0.01；與CD40L刺激組比較，

2.4 DHEA對NO濃度的影響

各組NO濃度差異有統計學意義(F=12.47，P<0.01)。與空白對照組比較，CD40L刺激組NO濃度明顯降低(18.22±3.43μmol/L vs 12.38±2.11μmol/L，t=7.12，P<0.05)。中、高濃度DHEA組NO較CD40L組明顯增加，濃度分別為15.21±2.38μmol/L和18.45±2.76μmol/L(t=5.23、6.87，P<0.05)。見圖4。

注：與空白對照組比較，* P<0.05；與CD40L刺激組比較，

3 討 論

在AS發生發展的早期階段，血管內皮功能障礙發揮著重要作用，損傷的血管內皮可能失去原有的生理功能，極易發生炎癥反應、脂質沉積、血栓形成，從而加速AS[8]。因此血管內皮不僅是重要的血管屏障，而且是調節血管舒張功能和血管結構的內分泌器官。生理條件下，內皮細胞在各種刺激下由eNOS催化左旋精氨酸的氧化反應，生成并不斷釋放NO到周圍組織和細胞中，調節血管張力和血管擴張；同時NO還具有抗凝、抗氧化、抗細胞黏附等作用，可阻止血小板聚集和白細胞對血管內皮的黏附，抑制平滑肌細胞的增殖，介導平滑肌細胞舒張，從而發揮心血管保護作用[9]。病理狀態時，內皮細胞功能紊亂，其主要表現為NO減少。在炎性細胞因子作用下，eNOS活性減弱，NO合成量減少，會加重血管內皮舒張/收縮障礙。

ET具有很強的促血管收縮作用，其3個亞型中ET-1對心血管系統起著重要的作用。ET-1主要由內皮細胞在血管壁剪切力、壓力等物理因素以及腎上腺素、血管緊張素、血栓素等刺激下合成和分泌，用以調節局部血管張力，促進血管收縮和炎癥反應的形成，并能促進平滑肌細胞增殖、氧化應激和激活血小板。而NO能抑制ET-1的合成，拮抗ET-1功能，維護血管內皮的正常舒張活性。Alvarez等[10]研究證實ET-1可使冠狀動脈強烈痙攣，具有心肌細胞毒性作用和致心律失常作用，ET-1活性的異常升高對于心肌缺血和心肌梗死的發生有重要意義。ET-1和NO的比例失調會導致冠脈管腔狹窄，加重心肌缺血缺氧，使冠心病更加惡化。因此，改善血管內皮細胞功能，抑制冠脈收縮，增加冠脈血流量，已經成為冠心病治療研究中的重要靶點。

DHEA是人體含量最高的一種內源性雄激素，其對心血管系統的保護機制與其調節內皮細胞功能密切相關。有報道[11]DHEA可以使離體兔主動脈和冠狀動脈顯著擴張，能通過抑制平滑肌細胞的增殖調節內皮損傷后的血管重塑；并且DHEA還能通過G蛋白藕聯受體促進血管內皮NO的合成。Hayashi等[12]通過高脂飲食兔來研究DHEA對AS影響的作用機制，結果表明DHEA可通過轉化為雌激素并促進NO生成而發揮抗AS作用。

炎性細胞因子CD40/CD40L是介導內皮細胞損傷的重要介質，其相互作用可誘導內皮細胞內信號轉導，激活炎性因子、黏附分子和趨化因子表達，促進白細胞黏附和血小板聚集，形成AS早期炎癥反應并加速斑塊形成和不穩定。我們之前的研究表明，DHEA能顯著抑制CD40和CD40L的表達[13]，本實驗進一步探討了DHEA對CD40L誘導的內皮細胞舒張功能的影響，結果顯示，DHEA不僅能抑制CD40L誘導的ET-1分泌及ET-1 mRNA的表達，還能促進eNOS mRNA表達和來自于eNOS的NO含量的增加，因而能減少CD40L的促內皮損傷作用，并激活eNOS促內皮細胞釋放較多NO，減輕內皮細胞功能障礙，修復內皮細胞功能，對冠脈的損傷修復起到積極地保護作用。

綜上所述，DHEA能通過抑制ET-1表達，促進eNOS和NO生成來保護血管內皮細胞的舒張功能。該結果為臨床應用DHEA治療AS提供了部分實驗依據。

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本文第一作者簡介：

夏尊恩(1981-)，男，漢族，醫學博士，主管技師，主要從事動脈粥樣硬化與炎癥機制研究

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13 夏尊恩，李 艷，汪 明，等. 脫氫表雄酮對人臍靜脈內皮細胞CD40 /CD40L表達的影響[J]. 微循環學雜志, 2008, 18(1):39-41.

Influence of Dehydroepiandrosterone on Diastolic Function in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

XIA Zun-en，ZHOU Quan，LI Yan#

Department of Clinical Laboratory, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China;#Corresponding author

Objective: To investigate effect of dehydroepiandrosterone (DHEA) on expression of NO, ET-1 and eNOS in human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) and influence of DHEA on diastolic function in HUVECs.Method: HUVECs were incubated with 1μg/m1 CD40L for 24 hours with or without pretreated by different concentration of DHEA(10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L). ET-1 and eNOS mRNA expression were detected by RT-PCR. The levels of NO and ET-1 were measured by nitrate reduction test and ELISA. Results: Compared with control group, CD40L increased the mRNA expression of ET-1 and level of ET-1 in HUVECs(allP<0.01). Meanwhile, the eNOS mRNA expression and NO content in HUVECs in CD40L group were decreased(allP<0.01). DHEA with different concertration could down-regulate the ET-1 mRNA and ET-1 expression and promote the eNOS mRNA expression and NO content in HUVECs,espically the most obvious change was in 10-6mol/L DHEA group(P<0.05,P<0.01). Conclusion: DHEA could regulate vascular endothelial cells diastolic function by promoting NO generation and inhibiting ET-1 expression.

Dehydroepiandrosterone; Human umbilical vein endothelial cells; NO; ET-1; Diastolic function

國家自然科學基金(81101319)

武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060；#

本文2016-09-02收到，2016-10-10修回

R392.11

A

1005-1740(2016)04-0007-05