葉酸受體蛋白1對卵巢癌患者的臨床應用價值

曾正蓮 韓利蓉 曹偉偉

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葉酸受體蛋白1對卵巢癌患者的臨床應用價值

曾正蓮 韓利蓉 曹偉偉

目的：探討人卵巢組織葉酸受體蛋白1(FOLR1)表達量對卵巢癌患者診斷、療效監測、化療耐藥和預后評估的臨床應用價值。方法：93例卵巢癌患者(卵巢癌組)按照組織學分型分為黏液性癌組(n=37)、漿液性癌組(n=48)和內膜樣癌組(n=8)；根據臨床分期分為Ⅰ—Ⅱ期組(n=39)和Ⅲ—Ⅳ期組(n=54)；根據有無淋巴結或遠處器官轉移分為有轉移組(n=21)和無轉移組(n=72)；根據臨床療效分為完全緩解組(CR組，n=31)、部分緩解組(PR組，n=29)、病情穩定組(SD組，n=14)和病情進展組(PD組，n=19)；根據化療耐藥情況分為化療耐藥組(n=37)和化療敏感組(n=56)。同期收治的卵巢良性腫瘤患者作為良性腫瘤組(n=60)。卵巢組織和功能正常婦女作為對照組(n=40)。采用Western Blotting技術檢測各組卵巢組織FOLR1相對表達量，比較卵巢癌組、良性腫瘤組和對照組FOLR1水平差異，比較不同臨床特征卵巢癌患者FOLR1水平差異，比較不同療效和是否耐藥卵巢癌患者FOLR1水平差異。通過FOLR1檢測結果繪制ROC曲線，計算最佳臨界值，并以此臨界值評估卵巢癌患者60個月生存率。結果：與對照組比較，卵巢癌組和良性腫瘤組FOLR1相對表達量均顯著升高(t=30.577、20.527,P<0.01)，卵巢癌組較良性腫瘤組升高更明顯(t=17.051,P<0.01)。與漿液性癌組比較，黏液性癌組和內膜樣癌組FOLR1相對表達量均顯著降低(t=13.515、13.902,P<0.01)，黏液性癌組與內膜樣癌組FOLR1比較差異無統計學意義(t=0.187,P>0.05)。Ⅲ—Ⅳ期組患者FOLR1表達水平顯著高于Ⅰ—Ⅱ期組患者(t=10.834,P<0.01)，有轉移組FOLR1表達水平顯著高于無轉移組(t=10.335,P<0.01)。與CR組患者比較，PR組、SD組和PD組患者FOLR1表達水平均依次升高，PR組高于CR組(t=16.42，P<0.01)，SD組高于PR組(t=5.349，P<0.01)，PD組更高于SD組(t=9.732，P<0.01)。化療敏感組患者FOLR1表達水平顯著高于化療耐藥組(t=16.495,P<0.01)。FOLR1≥3.184癌癥患者60個月生存率僅為19.14%，而FOLR1<3.184癌癥患者60個月生存率達39.23%，兩者差異有統計學意義(χ2=4.715,P<0.01)。結論：卵巢癌患者FOLR1表達量顯著升高可以作為卵巢癌早期診斷、化療耐藥判斷的生物標志物之一。

葉酸受體蛋白1；卵巢癌；耐藥；診斷；預后

葉酸受體蛋白1(Folate Binding Protein1,FOLR1)是一種膜蛋白，通過與糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol,GPI)特異性結合，介導葉酸進入細胞內；而葉酸對細胞的增殖、分裂和組織生長具有重要的調節作用[1,2]。國外研究表明，FOLR1的上述作用可同時使正常細胞和腫瘤細胞生長，其中對調節腫瘤細胞生長更明顯[3]；國內研究者報道卵巢癌、肺癌、肝癌、腎癌、乳腺癌等組織中FOLR1呈高表達，而正常組織FOLR1表達量較低，因而認為FOLR1可以作為某些腫瘤的診斷指標[4,5]。本文檢測分析卵巢癌患者卵巢組織FOLR1表達水平及其與臨床表現特征、臨床療效、臨床耐藥和患者生存率的關系，為FOLR1的臨床診斷、化療監測和療效評估作用提供實驗室依據。

1 資料與方法

1.1 對象和分組

2008-08─2011-02本院收治的93例卵巢癌患者(卵巢癌組)，年齡19-82歲，平均43.7±6.9歲，按照WHO卵巢組織學分類法[6]分為黏液性癌組(n=37)、漿液性癌組(n=48)和內膜樣癌組(n=8)；按照國際婦產科聯盟(International Federation of Gynecologyand Obstetrics,FIGO)分期標準[7]分為Ⅰ-Ⅱ期組(n=39)和Ⅲ-Ⅳ期組(n=54)；根據有無淋巴結或遠處器官轉移分為有轉移組(n=21)和無轉移組(n=72)。所有患者均行癌瘤減滅術，并留取樣本；術后均行順鉑聯合紫杉醇或順鉑、博來霉素、長春新堿的化療方案。根據臨床療效分為完全緩解組(CR組，n=31)、部分緩解組(PR組，n=29)、病情穩定組(SD組，n=14)和進展組(PD組，n=19)；根據化療耐藥情況分為化療耐藥組(n=37)和化療敏感組(n=56)。同期本院收治的卵巢良性腫瘤患者作為良性腫瘤組(n=60)，年齡24-76歲，平均43.5±7.4歲，其中黏液性瘤27例，漿液性瘤33例，均行手術切除，并保留樣本。另選卵巢正常婦女作為對照組(n=40)，年齡21-82歲，平均43.8±6.5歲，其中子宮肌瘤36例，宮頸癌4例；經患者同意，手術切除肌瘤時切取少許卵巢組織樣本。三組卵巢組織樣本均送本院病理科行常規組織病理學HE染色確診。對照組、良性腫瘤組和卵巢癌組三組年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，且患者均知情同意。

1.2 卵巢癌治療方法及療效

1.2.1 治療方法：所有患者均于入院后接受卵巢腫瘤細胞減滅術，包括雙附件、全子宮、轉移瘤、大網膜以及腹、盆腔淋巴清掃術；術后患者進行化療，化療方案：順鉑聯合紫杉醇或順鉑、博來霉素、長春新堿，3周為一個療程，共進行6個療程。

1.2.2 療效和耐藥標準：(1)療效評價參考WHO實體腫瘤療效標準[8]，CR：所有病灶完全消失，維持4周以上；PR：病灶縮小50%以上，維持4周以上；SD：各病灶最大垂徑乘積之和縮小不足50%，或增大未超過25%，維持4周以上；PD:一個或多個病灶增大超過25%，或出現新病灶。(2)耐藥標準參考美國婦科腫瘤學會(Society of Gynecologic Oncology,SGO)標準[9]，初次以鉑類藥物為基礎的化療達到臨床緩解，但停止化療6個月內出現復發為化療耐藥型；反之為化療敏感型。

1.3 FOLR及檢測方法

1.3.1 組織樣本處理：三組患者所取卵巢組織，一部分置于4%中性甲醛中送病理診斷，余下部分立即保存于液氮罐中，嗣后充分研磨，加入蛋白裂解液(199μl RAPI+1μl PMSF)冰上充分裂解30min，4℃、3 000r/min(離心半徑14.3cm)離心10min，留取上清液，置于—80℃冰箱保存待檢。

1.3.2 主要檢測試劑與儀器： 蛋白裂解液購自武漢博士德生物工程有限公司(批號：080121)，兔抗人FOLR1多克隆抗體(批號：071209)、羊抗人GAPDH多克隆抗體(批號：191025)、聚偏二氟乙烯膜購自北京眾益中和生物技術有限公司。高速離心機(德國Eppendorf公司5424型)，Odyssey成像系統(美國LI-COR公司)，圖像分析軟件為系統自帶。

1.3.3 Western Blotting檢測FOLR1表達： 向組織中加入蛋白提取液，勻漿器打成勻漿，4℃振蕩孵育過夜；BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。將20μg蛋白提取液置于SDS-PAGE電泳，分離蛋白，100mA、40min電轉后將PVDF膜取出。5%脫脂牛奶封閉3h，PBS沖洗3次，5min/次，再分別加入兔抗人FOLR1多克隆抗體(1∶800稀釋)和羊抗人GAPDH多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1h，4℃過夜；PBS沖洗3次，5min/次；再分別加入熒光標記的羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)，室溫下振搖3h，PBS沖洗3次，5min/次。熒光圖像掃描及條帶灰度值分析，FOLR1相對表達量以樣本條帶與GAPDH條帶灰度比值表示。

1.4 隨訪5年生存率

卵巢癌患者生存率的隨訪采用門診復查、電話詢訪等方式，起始于化療開始第2天，截止于2016-02，歷時60個月。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 三組患者卵巢組織FOLR1水平

對照組、良性腫瘤組和卵巢癌組FOLR1相對表達量依次為1.774±0.138、3.084±0.387、4.795±0.617，差異有統計學意義(F=78.302,P<0.01)。與對照組比較，卵巢癌組和良性腫瘤組FOLR1相對表達量均顯著升高(t=30.577、20.527,P<0.01)，卵巢癌組較良性腫瘤組升高更明顯(t=17.051,P<0.01)。

2.2 不同臨床特征卵巢癌患者FOLR1表達水平比較

不同組織分型卵巢癌患者FOLR1表達水平差異有統計學意義(F=104.603,P<0.01)。與漿液性癌組比較，黏液性癌組和內膜樣癌組FOLR1相對表達量均顯著降低(t=13.515,13.902,P<0.01) ，黏液性癌組與內膜樣癌組FOLR1表達差異無統計學意義(t=0.187,P>0.05)；Ⅲ—Ⅳ期組患者FOLR1表達水平顯著高于Ⅰ—Ⅱ期組患者(t=10.834,P<0.01)；有轉移組FOLR1表達顯著高于無轉移組(t=10.335,P<0.01)。見表1。

2.3 不同療效及有無耐藥患者FOLR1水平比較

CR、PR、SD、PD組患者FOLR1表達水平差異具有統計學意義(F=352.106,P<0.01)；與CR組比較，PR、SD、PD組患者FOLR1表達水平依次升高(t=16.412、18.089、30.985,P<0.01)；SD組較PR組升高(t=5.349,P<0.01)；PD組更高于SD組(t=9.732,P<0.01)。化療敏感組患者FOLR1表達水平顯著高于耐藥組(t=16.495,P<0.01)。見表2。

表1 不同特征卵巢癌患者FOLR1水平比較±s)

注：與黏液性癌組比較，1)P<0.01；與內膜樣癌組比較，2)P<0.01；與Ⅰ—Ⅱ期組比較，3)P<0.01；與無轉移組比較，4)P<0.01

表2 不同療效及有無耐藥卵巢癌患者FOLR1水平比較±s)

注：與CR組比較，1)P<0.01；與PR組比較，2)P<0.01；與SD組比較，3)P<0.01；與耐藥組比較，4)P<0.01

2.4 卵巢癌患者隨訪率及FOLR1水平與其生存率的關系

93例卵巢癌患者失訪7例，失訪原因：住址或電話變更失聯6例，轉院治療1例。成功隨訪86例(92.47%)，隨訪時間7-60個月，平均(38.1±3.9)個月。通過繪制ROC曲線和計算約登指數獲取FOLR1診斷卵巢癌的最佳臨界點為3.184(圖1)。以FOLR1表達≥3.184和<3.184計算生存率，繪制生存曲線，FOLR1表達≥3.184癌癥患者60個月生存率僅為19.14%，而<3.184癌癥患者60個月生存率達39.23%，兩者差異具有統計學意義(χ2=4.715,P<0.01，圖2)。

3 討 論

FOLR屬于人葉酸受體蛋白家族成員之一，目前已經發現三種亞型：FOLR1、FOLR2、FOLR3，其中FOLR1可介導葉酸進入細胞內發揮重要作用。Holm等[10]報道FOLR1蛋白完全暴露于細胞外膜(由GPI固定)，通過細胞吞飲轉移機制將葉酸及四氫葉酸轉運至細胞內，參與細胞DNA，包括腫瘤細胞DNA的增殖與修復，因而認為FOLR1表達水平與惡性腫瘤細胞增殖等密切相關。 還有研究[11，12]發現人體正常組織中FOLR1表達水平較低，而在一些惡性實體瘤如肺癌、肝癌、結直腸癌、卵巢癌、宮頸癌組織中，FOLR1過度表達，其中90%以上卵巢癌組織呈FOLR1高表達，而且明顯高于乳腺癌和惡性間皮瘤。因此建議將FOLR1作為卵巢癌診斷標志物。本研究結果顯示，卵巢癌患者卵巢組織FOLR1表達量顯著高于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織，與上述研究結果相一致，而且本研究發現Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌患者FOLR1表達水平顯著高于Ⅰ—Ⅱ期患者，發生淋巴結和遠處轉移患者FOLR1水平顯著高于未發生轉移者，表明FOLR1水平升高或可反映卵巢癌的發展和惡化程度。

圖1 卵巢癌組織FOLR1表達水平的ROC曲線

圖2 卵巢癌患者生存曲線

腫瘤減滅術和化療是治療卵巢癌的主要方法，本文采用順鉑聯合紫杉醇或順鉑、博來霉素、長春新堿治療6個療程后，完全緩解(CR)者僅33.33%(31/93)，與其它文獻報道結果相近，治療機制可能是葉酸與CD3抗體形成偶聯物，并與T細胞抗原受體(TCR)特異性結合成復合物，靶向作用于FOLR1而介導組織出現強烈免疫反應，誘導T細胞活化而使腫瘤細胞發生溶解。隨著病情的好轉，免疫反應逐漸減弱，FOLR1也隨之降低[13]，這種低CR的主要原因是化療耐藥。Desmoulin等[14]報道有12%的卵巢癌患者表現出原發性耐藥，88%卵巢癌患者治療初期對化療敏感，但有75%的患者最終因耐藥而導致化療失敗。這可能與患者內源性葉酸和FOLR1水平有關，因 FOLR1表達下調會抑制腫瘤細胞對鉑類和甲氨蝶呤等化療藥物的攝取，從而使腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥[15，16]。本研究中化療耐藥型卵巢癌患者FOLR1表達水平顯著低于化療敏感型患者，符合以上推論。同時表明FOLR1表達水平亦可作為化療耐藥的評價指標之一。但腫瘤耐藥機制十分復雜，有多種酶、蛋白、信號通路參與其中，FOLR1水平變化是原因還是結果，作用機制如何，均需深入研究。

對于采用FOLR1表達水平評價卵巢癌患者5年生存率，尚未見到相關報道。本文通過ROC曲線獲取最佳診斷點為3.184，以此臨界值統計分析93例卵巢癌患者5年生存率，結果顯示FOLR1≥3.184患者5年生存率為19.14%，而<3.184患者5年生存率為39.23%，后者顯著高于前者，說明FOLR1對卵巢癌遠期預后評估亦有指導作用。

卵巢癌發病隱匿，多數患者確診時已是中晚期[17]，而Ⅲ-Ⅳ期卵巢癌患者5年生存率(35%)明顯低于Ⅰ—Ⅱ期(60%)[18]，因此，加強無癥狀患者的早期篩查和診斷對改善患者預后具有重要意義。已有報道早期卵巢癌患者血清FOLR1水平顯著升高，可以作為卵巢癌早期診斷的敏感指標[19]。由于葉酸與FOLR1具有高度親和力，可以利用葉酸與化療藥物偶聯，并將藥物靶向轉運至腫瘤細胞內[20]，作為化療靶向治療路徑，這可能成為FOLR1對卵巢癌診斷作用的重要研究方向，為提高臨床療效和降低耐藥性作出貢獻。

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本文第一作者簡介：

曾正蓮(1970-)女，漢族，副主任技師，主要從事臨床化學檢驗

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Clinical Value of Folate Binding Protein 1 in Diagnosis and Chemotherapy Resistance Detection on Ovarian Cancer Patients

ZENG Zheng-lian， HAN Li-rong， CAO Wei-wei

Department of Clinical Laboratory,The First People's Hospital of Tianmen City,Tianmen 431700,China

Objective: To explore the clinical value of folic acid-binding protein 1(FOLR1) in diagnosis, efficacy monitoring, chemotherapy resistance and prognosis assessment on ovarian cancer patients.Method: A total of 93 cases of ovarian cancer patients(malignant group)according to the histological classification were divided into the mucinous carcinoma group (n=37), serous cancer group (n=48), endometrial carcinoma group (n=8), according to clinical stage were divided into Ⅰ-Ⅱ Group (n=39) and Ⅲ-Ⅳ group (n=54), according to whether lymph node or distant organ metastasis were divided into two groups (n=21 andn=72),according to the clinical efficacy were divided into CR group (n=31), PR group (n=29), SD group (n=14) and PD group (n=19),according to

Folate binding protein 1; Ovarian cancer; Drug resistance; Diagnosis; Prognosis

R737.31

A

1005-1740(2016)04-0033-06

湖北省天門市第一人民醫院檢驗科，天門 431700

本文2016-07-01收到，2016-08-17修回

the resistance of chemotherapy were divided into chemotherapy resistant group (n=37) and chemotherapy sensitivity (n=56).Another 60 cases of ovarian benign tumor patients were selected as benign group and 40 cases of normal ovarian women as control group.FOLR1 relative expression level in the ovarian tissues of each group were detected by Western blot, the level of FOLR1 in ovarian cancer group, benign tumor group and control group were compared,the level of FOLR1 in different clinical features of ovarian cancer patients were compared,the level of FOLR1 in different curative effect and drug resistant ovarian cancer were compared.The ROC curve was drawn by FOLR1 test, and the optimal critical value was calculated, and the survival rate of patients with ovarian cancer was evaluated by the critical value of 60 months.Results: FOLR1 relative expression level in control group was(1.774±0.138),benign group was(3.084±0.387),malignant group was(4.795±0.617),the relative expression of FOLR1 in malignant group was significantly higher than that in benign group and control group, the relative expression of FOLR1 in benign group was significantly higher than that in control group (P<0.01).Serous carcinoma FOLR1 expression level was significantly higher than that of mucinous carcinoma and endometrial cancer (P<0.01),Ⅲ-Ⅳ stage of varian cancer FOLR1 expression level was significantly higher than those in Ⅰ-Ⅱ stage(P<0.01), lymph node or distant organ metastasis FOLR1 expression level was significantly higher than those without metastasis (P<0.01).The curative effect of CR, PR, SD, PD patients with FOLR1 expression levels were increased, the differences between each groups with statistically significant (P<0.05).The level of FOLR1 expression in chemotherapeutic drug resistance ovarian cancer patients was significantly lower in chemotherapy sensitivity patients(P<0.01).With FOLR1 positive and negative as the observation index, the 5 year survival rate of FOLR1 positive group was 19.1%, and 39.2% in FOLR1 negative group,two group 5 year survival rate with statistically significant (χ2=4.715,P<0.01).Conclusion: FOLR1 in ovarian cancer were significantly increased which can be used as a biomarker for early diagnosis and chemotherapy resistance of ovarian cancer.