復合酶水解法從羅非魚血液中提取血紅素及其性質研究

岑劍偉,胡慶蓉,魏 涯,楊賢慶,黃 卉,李來好,*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室, 國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300; 2.汕頭市質量計量監督檢測所,廣東汕頭 515063)

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復合酶水解法從羅非魚血液中提取血紅素及其性質研究

岑劍偉1,胡慶蓉2,魏 涯1,楊賢慶1,黃 卉1,李來好1,*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室, 國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300; 2.汕頭市質量計量監督檢測所,廣東汕頭 515063)

為更加科學有效地利用中國豐富的羅非魚血液資源,本文建立了一套經復合酶水解、再通過酸沉淀和真空冷凍干燥等步驟,從羅非魚血液中提取血紅素的新工藝。在此條件下,血紅素提取率達到80.9%,產品純度為28.2%,同時對所得產品的光譜特征、分子量大小、鐵離子價態和外觀性狀等物理性質進行了研究。結果分析表明:產品特征波長為385 nm,特征成分為血紅素,產品中約20%的血紅素以與大分子肽鏈結合的形式存在,相對分子量在5～10 ku范圍內,而約75%的血紅素則可能以單體或者與小分子肽鏈結合的形式存在,相對分子量小于5 ku;產品中二價鐵殘留率為37%,在提取過程中應加強二價鐵的保護,相關研究結果可以為羅非魚血液中血紅素的開發應用提供重要的理論依據和技術支撐。

羅非魚血,血紅素,復合酶,提取,性質研究

中國是世界上最大的羅非魚養殖生產國家,2014年我國羅非魚產量達到155萬t,其中約有50%的產品用于加工生產,然而被工廠當作廢水排放的羅非魚血達1.6×104t[1-2],造成資源的巨大浪費和引發嚴重的環境污染問題。血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是羅非魚血液中含量最高的一類蛋白(約占血液總蛋白的80%),它由血紅素與珠蛋白結合成四聚體(兩條α鏈和兩條β鏈)的形式存在,相對分子質量約為65000,其中珠蛋白約占96%,血紅素占4%[3]。血紅素(Heme)是由1個原卟啉環中鑲嵌1個亞鐵離子(Fe2+)構成的化合物,分子式為C34H32FeN4O4,相對分子量為616.49。它參與機體的多項代謝活動,發揮著重要的生理功能[4],因此,在食品、醫藥和化工等領域得到了廣泛的應用:如添加到糖果、面食、醬油和肉制品等食品中,能夠在不影響食品原有品質的同時有效地起到補鐵的作用,改善肉制品的外觀和口感[5-7];血紅素作為制備膽紅素的前體,可作為制備抗癌特效藥-血卟啉衍生物的主要原料等[8]。

因此,本文以羅非魚血為原料,在對酶種類、酶濃度、底物濃度、酶解時間等酶解工藝條件進行研究的基礎上,采用復合酶水解法的最佳工藝條件處理血紅蛋白[9],再經過酸沉淀和離心等操作提取血紅素,并通過紫外-可見光譜掃描圖譜分析、高效液相色譜定性分析、超濾技術定性分析、Fe2+/Fe3+組成分析和外觀性狀觀察等實驗,對產品的光譜特征、分子量大小、含量和外觀性狀等性質進行研究。旨在為羅非魚血液資源綜合利用研究提供可靠的理論和技術支撐,具有重要的理論研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚 廣州華潤萬家超市新港西路店,鮮活,約500 g/尾;血紅素標準品 Sigma公司,生物試劑;氫氧化鈉、冰醋酸 廣州化學試劑廠,分析純;1%乙酸、四氫呋喃 美國TEDIA公司,色譜純;鄰菲羅啉試劑 廣州康龍生物技術有限公司,分析純;復合蛋白酶 廣州齊云生物技術有限公司,生物試劑。

Agilent 1100高效液相色譜工作站 Agilent公司;AA-6300C型原子吸收分光光度計 島津(SHIMADZU)公司;UV-2450/2550型紫外-可見分光光度計 島津(SHIMADZU)公司;Milipore Labscale超濾超濾系統 Milipore公司;ALPHA 1-4 LSC 冷凍干燥機 德國Christ公司;XSP-2C雙目型顯微鏡 上海蔡康光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血紅素含量測定 紫外-可見分光光度法(UV)[10]。

相關計算:

提取率(%)=產品中血紅素含量(g)×100/血樣中血紅素含量(g);

純度(%)=血紅素含量(g)×100/所得產品重量(g)。

1.2.2 樣品準備 將收集到的羅非魚血紅細胞經2～3次生理鹽水洗滌后,用2倍體積的蒸餾水稀釋紅細胞,經600 W、20 min超聲波輔助細胞破膜處理后,5000×g離心15 min,收集上層潔凈血紅細胞液備用。

1.2.3 復合酶水解法提取血紅素 參考文獻[8]的方法,將制備的血紅細胞液樣品加pH8.0的磷酸緩沖液調節至血紅蛋白濃度為6%,量取300 mL該血樣,按酶底比8000 U/g將復合酶添加到血樣中,調節pH至8.0,40 ℃條件下勻速攪拌水解2 h。酶解結束后,將酶解液進行沸水浴處理15 min左右,迅速冷卻后離心(3000×g,10 min),去除沉淀。

1.2.4 酸沉淀純化血紅素 用冰醋酸調節樣液pH6.0,充分攪拌后靜置20 min,離心(3000×g,10 min),收集血紅素沉淀,經真空冷凍干燥得終產品。

1.2.5 血紅素產品物理性質測定

1.2.5.1 紫外-可見光譜掃描 在190～800 nm的波長范圍內,以溶劑0.1 mol/L NaOH作空白,以16 mg/L血紅素標準溶液為對照,對80 mg/L的樣品溶液掃描光譜,進行圖譜特征分析。

1.2.5.2 高效液相色譜(HPLC)定性研究 將樣品(以含血紅素28.2%計)配制成血紅素含量與血紅素標準溶液(16 mg/L)接近的濃度,經0.45 μm膜過濾,濾液上機檢測。色譜條件為色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm/5 μm);流動相:1%乙酸∶四氫呋喃=65∶35;進樣量:10 μL;流速:1 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:405 nm[11]。

1.2.5.3 超濾實驗 精確稱取產品80 mg,用0.1 mol/L NaOH溶液將其溶解并定容至500 mL。量取400 mL樣品溶液先后經50、10、5 ku孔徑大小的膜超濾處理,分別測定每次過膜后的血紅素含量,定性分析產品的分子量分布情況及成分組成情況。

1.2.5.4 Fe2+和Fe3+含量測定 總鐵含量測定:原子吸收光譜法(AAS)。樣品作如下預處理:量取10 mL 160 mg/L的樣品溶液,加入15 mL濃硝酸,微波消解15 min,定容至100 mL。上機檢測標樣溶液和樣品溶液,由回歸方程計算樣品中的總鐵含量。

Fe2+含量測定:鄰菲羅啉分光光度法[12]。

Fe3+含量測定:Fe3+含量=總鐵含量-Fe2+含量

1.2.5.5 外觀性狀觀察 用顯微鏡觀察干燥后的樣品和血紅素標準品的外觀性狀。

2 結果與討論

2.1 血紅素提取工藝分析

通過堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶提取血紅素效果對照實驗表明,復合酶的提取率最高。因此,本實驗選用復合酶酶解提取血紅素,其最適反應pH為8.0,最適反應溫度為40 ℃[9]。通過對酶解底物濃度、酶底比和酶解時間三個主要影響因子進行單因素實驗和L9(34)正交實驗,確定的最佳酶解工藝條件為底物濃度6%、酶底比8000 U/g,酶解時間2 h[9]。

血紅蛋白經水解后,所得水解液中含有多種成分,包括血紅素、血紅素肽結合體和各種肽片段等。酶解反應結束后進行沸水浴處理,可以使酶變性失活,終止酶解反應,又可以使熱不穩定性物質(如血紅蛋白)變性沉淀。因此,通過沸水浴處理后離心可以起到較好的除雜作用。根據文獻報道,血紅素不溶于酸性溶液中,在酸性條件下會發生沉淀[13];同時,珠蛋白在等電點pH3.0附近時會與血紅素發生解離,從而使血紅素肽的結構遭到破壞;同時血紅蛋白水解液中肽片段的等電點約為4.7[14]。調節pH6.0不僅可以使血紅素單體和血紅素肽充分沉淀,而盡量減少其他肽鏈沉淀,有效的提高血紅素的得率;同時因為遠離了珠蛋白等電點,又不會使血紅素肽因解離而失去功能活性。按照上述工藝條件操作,通過測定各步驟中血紅素含量和干物質重量,可計算相關評價指標變化情況如表1。

表2 超濾中的血紅素含量測定結果

Table 2 Content determination results of heme during utrafiltration

膜孔徑(ku)50105血紅素含量(mg/L)4453±014337±013398±01血紅素通過率(%)987961753

表1 血紅素提取過程中各指標變化情況

Table 1 The variation of indexes during extraction of heme

評價指標樣品準備復合酶水解酸沉淀血紅素含量(g)067505690546干物質重量(g)18000133291934血紅素提取率(%)100843809純度(%)3843282

由表1可知,血紅細胞液經復合酶水解和酸沉淀后,血紅素提取率為80.9%,樣品純度為28.2%。張亞娟[14]等報道的血紅素提取率為57.5%,純度為24.47%。吳保承[15]等報道的血紅素提取率為77.2%。與現有文獻報道相比,本文中血紅素提取率、純度均達到較高水平。

2.2 血紅素產品物理性質分析

酶法制備的產品中血紅素含量為28.2%,其可能包含幾種成分:(1)血紅素肽結合體;(2)血紅素單體;(3)難分離的肽鏈等。為了進一步明確產品的組成成分和有關物理特征,實驗通過紫外-可見光譜掃描圖譜分析、高效液相色譜定性分析、超濾技術定性分析、Fe2+/Fe3+組成分析和外觀性狀分析等對產品的物理性質做相關研究。

2.2.1 紫外-可見光譜掃描圖譜分析 由圖1可見,樣品的光譜掃描圖譜與血紅素標準品的圖譜峰型基本一致,且其特征吸收波長為385 nm,與文獻[10,14-15]報道的血紅素特征波長一致,表明樣品中的特征性成分為血紅素;樣品峰面積稍大于標準品,而兩者的濃度比為5∶1,可大致推斷出樣品中血紅素含量大于且接近20%,與測定值28.2%相吻合,證實了上述結果的準確有效性。

圖1 血紅素樣品與標準品的紫外-可見光譜Fig.1 UV-Vis curve of heme product and the standard

2.2.2 高效液相色譜定性分析 流動相的性質和組成是影響色譜柱效、分離選擇性的重要因素。目前文獻報道的HPLC法測定血紅素時,流動相多采用乙腈、甲醇和水等[14]。考慮到血紅素與色譜柱產生較強作用導致拖尾,直接影響測定結果的準確性,因此,本實驗采用1%乙酸和四氫呋喃為流動相,可有效克服圖譜的拖尾現象。用高效液相色譜法測定血紅素,檢測波長在385 nm處時色譜峰的分離不如405 nm,因此將此法檢測波長定為405 nm。

由圖2可知，峰形良好,且只有一個峰;血紅素標準品的保留時間為7.074 min,峰面積為1030 mAU·mL;樣品的保留時間為7.160 min,峰面積為987 mAU·mL,由此可知,樣品的保留時間和峰面積均與血紅素標準品一致,表明樣品中的特征性成分為血紅素,且含量與紫外-可見分光光度法測定結果一致,為28.2%。

圖2 血紅素標準品(a)和樣品(b)的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of heme standard(a)and the product(b)

2.2.3 超濾定性分析 超濾前的血紅素含量為45.12 mg/L,由表2可知,經過50 ku和10 ku的膜處理后,血紅素含量變化不明顯,只有很小的一部分被截留,表明絕大多數的血紅蛋白被水解成了多肽鏈;經過5 ku的膜處理后,血紅素含量為超濾前的75.3%。表明產品的分子量主要集中分布在兩個范圍:一是5～10 ku,這部分約占血紅素總量的20%,主要是血紅素與大分子肽鏈的結合物;二是小于5 ku,這部分約占血紅素總量的75%,可能含有血紅素單體或者血紅素和小分子肽鏈的結合物。

2.2.4 Fe2+和Fe3+含量分析 鐵原子在血紅蛋白中與血紅素以Fe2+的形式結合,酶解和分離純化過程中,血紅蛋白原有的穩定結構被破壞,使Fe2+更容易與氧氣接觸而氧化成Fe3+等高價鐵[4]。由表3可知,樣品中60%的鐵被氧化成Fe3+,由于Fe2+比Fe3+對人體的作用更為關鍵,因此,在產品生產過程中應該加強二價鐵的保護。

表3 樣品中Fe2+和Fe3+含量

Table 3 The content of Fe2+and Fe3+in the sample

鐵元素類型總鐵Fe2+Fe3+濃度(mg/L)0392±0010147±00050235±0005比例(%)1003760

2.2.5 外觀性狀分析 在顯微鏡下觀察,血紅素標準品為紫色針狀晶體,樣品呈紫色針狀晶體或藍紫色粉末狀,證實產品中不止含有血紅素單體一種物質,可能還含有血紅素肽等其他物質。

3 結論

采用最佳的復合酶水解工藝條件從羅非魚血液中提取血紅素,經過酶解、熱處理、離心和酸沉淀等技術處理后,血紅素提取率達到80.9%,純度為28.2%。與現有文獻報道相比,本文中血紅素提取率、純度均達到較高水平。

紫外-可見光譜掃描和HPLC定性分析發現,產品特征波長為385 nm,產品中的特征成分為血紅素,且含量與28.2%一致;超濾定性分析發現,所得產品中約20%的血紅素以與大分子肽鏈結合的形式存在,相對分子量在5～10 ku范圍內,而約75%的血紅素則可能以單體或者與小分子肽鏈結合的形式存在,相對分子量小于5 ku;Fe2+和Fe3+含量分析可知,樣品中二價鐵殘留率為37%,因此,在產品生產過程中應該加強二價鐵的保護;外觀性狀觀察發現,樣品呈紫色針狀晶體和藍紫色粉末狀兩種形態,證實產

品中不止含有血紅素單體一種物質,可能還含有血紅素肽等其他物質。相關研究結果為探明產品的功能特性提供了一定的數據支持,具有重要的參考價值。

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Characterization of heme from tilapias blood extracted by protamex hydrolysis

CEN Jian-wei1,HU Qing-rong2,WEI Ya1,YANG Xian-qing1,HUANG Hui1,LI Lai-hao1,*

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences;Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China； 2.Guangdong Shantou Quality and Measuring Supervision Testing Institute,Shantou 515063,China)

Inordertomakethescientificlyandeffectivelyuseoftilapiasbloodresources,aninnovativemethodtoextracthemefromtilapiasbloodwasestablished.Theprocedureconsistsofprotamexhydrolysis,acidprecipitation,vacuumfreezedrying,etc.Theresultsshowedthattheyieldofextractedhemewas80.9%,andthepuritywas28.2%.Thecharacterizationanalysisincludedspectralcharacteristics,molecularweight,Fe2+residualrateandmicroscopicexamination,whichdemonstratedthesample’scharacteristicwavelengthwas385nmandtheprincipalcomponentwasheme. 20%ofthehemewasthecombinationofhemeandmacromolecularpeptidesandthemolecularweightwas5～10ku,but75%ofthehemeprobablywasthemonomerorcombinedwithsmallmolecularpeptides,themolecularweightwaslessthan5ku.TheFe2+residualrateofsamplewas37%,indicatedthatprotectingmeasurewasnecessarywhileextraction.Therelatedresearchresultscouldprovideimportanttheoreticalbasisandtechnicalsupportsforthedevelopmentandapplicationofhemoglobinoftilapiabloodinthefuture.

tilapiasblood;heme;protamex;extraction;characterization

2016-04-01

岑劍偉(1976-)，男，博士，副研究員，研究方向：食品質量與安全，E-mail:genvex@163.com。

*通訊作者:李來好(1963-)，男，博士，二級研究員，研究方向：水產品加工、水產品質量安全與水產標準化等，E-mail:laihaoli@163.com。

中國水產科學研究院基本科研業務費專項(2015B06YQ01)；中國水產科學研究院南海水產研究所中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目(2014YD06)；國家支撐計劃項目(2012BAD28B06)；羅非魚產業技術體系崗位科學家專項經費(CARS-49)；“揚帆計劃”引進創新創業團隊專項資助(2015YT02H109 )；國家支撐計劃項(2015BAD17B03)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)19-0058-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.003