超聲輔助提取野西瓜藤中葫蘆素B工藝的優化

趙春燕,劉鈺瑩,,馬 越,趙曉燕,張 超,*

(1.沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866; 2.北京市農林科學院蔬菜研究中心,果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室,農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,農業部都市農業(北方)重點實驗室,北京 100097)

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超聲輔助提取野西瓜藤中葫蘆素B工藝的優化

趙春燕1,劉鈺瑩1,2,馬 越2,趙曉燕2,張 超2,*

(1.沈陽農業大學食品學院,遼寧沈陽 110866; 2.北京市農林科學院蔬菜研究中心,果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室,農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,農業部都市農業(北方)重點實驗室,北京 100097)

采用超聲輔助法從野西瓜藤中提取葫蘆素B,研究料液比、乙醇體積分數、超聲時間和超聲溫度對野西瓜藤中葫蘆素B得率的影響,并以葫蘆素B得率為響應值,采用響應面分析方法優化葫蘆素B提取工藝。結果顯示:超聲處理溫度對葫蘆素B得率影響最大,其次是乙醇體積分數和超聲時間,當超聲溫度80 ℃、超聲時間30 min、乙醇體積分數75%時,葫蘆素B得率最高,可以達到84.7%,提取量為0.168 mg/g。

野西瓜,藤,超聲輔助,葫蘆素B,響應面法

葫蘆素B是四環三萜類化合物,是葫蘆素家族中含量最豐富的成員[1-2],具有保護肝、消炎、抗腫瘤、提高機體免疫力等功能[3-5]。近年來,從植物資源中提取葫蘆素的方法有乙醇回流法、超臨界CO2萃取法、超聲輔助法等[6-7],其中超臨界CO2萃取法從甜瓜蒂中提取葫蘆素B的得率為16.5 mg/g[8];乙醇回流法從甜瓜蒂中提取葫蘆素B的得率為10.7 mg/g[9];超聲輔助法從甜葫蘆中提取葫蘆素B的得率為7.98 mg/g[10]。比較上述3種提取成本和產品得率,超聲輔助提取法具有操作方便、省時、高效等特點,在成本與效率之間基本上達到平衡點。

野西瓜(Citrulluscolocynthis)是一種生活在沙漠地區的攀緣藤草本植物,在我國新疆、內蒙古等地有少量分布,是維吾爾族傳統用藥之一,具有消炎、止痛、解毒等功能[11-12]。本課題組首次檢測發現野西瓜藤(包括蔓和葉)含有葫蘆素B,含量達到0.198 mg/g。野西瓜藤資源豐富,生物產量大,且易于獲取,但是目前是農業廢棄物,直接拋灑在田間[13]。鑒于此,研究考察超聲輔助提取工藝對野西瓜藤中葫蘆素B得率的影響,采用單因素實驗結合響應面分析的方法優化超聲輔助提取工藝參數,以期為野西瓜藤資源的充分利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野西瓜藤 北京蔬菜研究中心農場采收;葫蘆素B標準品 四川省維克奇生物科技有限公司;無水乙醇(色譜純) 國藥集團化學試劑有限公司。

高效液相色譜儀，Agilent 1260(配有四元泵及自動進樣器、DAD 檢測器) 美國安捷倫公司;高速萬能粉碎機，FW100 天津市泰斯特儀器有限公司;數控超聲波清洗器，KQ-500DE 昆山市超聲儀器有限公司;電子天平，PL3002 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;布氏漏斗抽濾裝置 成都蜀牛科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葫蘆素B標準曲線的繪制 稱取葫蘆素B標準品0.2 mg,配制成質量濃度為0.2 mg/mL標準儲備液。分別量取該標準儲備液5、10、25、50和75 μL,配制成質量濃度分別為0.01,0.02,0.05,0.1,0.15 mg/mL的標準溶液,以葫蘆素B的質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:XBridge-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫25 ℃;流動相:A相:純水,B相:乙腈;梯度洗脫:0～30 min,50% B;30～45 min,50%～100% B;45～60 min,100%～50% B;流速1 mL/min;檢測波長228 nm[14]。

1.2.3 樣品中葫蘆素B含量的測定 在野西瓜成熟后,將野西瓜藤在60 ℃烘干至水分含量低于10%,使用FW100高速萬能粉碎機粉碎30 s,收集通過20目篩網的粉末,精確稱量干粉5 g,放入100 mL燒杯中,加入一定體積比的乙醇水溶液,封口膜封住燒杯,按一定的超聲條件(料液比、溶劑體積分數、超聲時間、超聲溫度)提取葫蘆素B,布氏漏斗抽濾后過0.45 μm濾膜,采用HPLC方法測定葫蘆素B峰面積,根據標準曲線計算樣品中葫蘆素B的含量。葫蘆素B得率計算公式為:

式中:e:葫蘆素B得率,%;c:樣品溶液中葫蘆素B質量濃度,mg/mL;v:加入的乙醇體積,mL;m:樣品中總葫蘆素B含量,mg。

1.2.4 單因素實驗 在固定溫度為60 ℃、乙醇體積分數為70%、超聲時間為20 min的條件下,考察不同料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)對葫蘆素B得率的影響;固定料液比為1∶14時,乙醇體積分數為70%、超聲時間20 min條件下,考察不同超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)對葫蘆素B得率的影響;固定料液比為1∶14時,超聲溫度為80 ℃、超聲時間20 min條件下,考察不同乙醇體積分數(50%,60%、70%、80%、90%)對葫蘆素B得率的影響;固定料液比為1∶14時,超聲溫度為80 ℃、乙醇體積分數為90%條件下,考察不同超聲時間(10、15、20、25、30 min)對葫蘆素B得率的影響。

1.2.5 響應面實驗設計 綜合單因素實驗結果,選取對葫蘆素B提取有顯著影響的乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度為因素,運用Design-Expert軟件設計實驗[15-16],分析并確定最佳提取工藝條件。

1.3 數據處理與統計

實驗所有數據均有三次重復,計算平均值和標準偏差。使用統計分析軟件DPS v7.05進行處理,Ducan’s新復極差法進行顯著性分析(p≤0.05)。采用Design-Expert軟件對所得數據進行回歸分析,圖像繪制采用Origin 8.0軟件(美國Origin Lab Corporation公司)。

2 結果與分析

2.1 葫蘆素B標準曲線繪制

圖1顯示葫蘆素B含量與峰面積呈線性關系。其回歸方程為Y=16347X-21.77843,相關性R2=0.9997,葫蘆素含量在0～0.20 mg/mL范圍內線性關系良好。

圖1 葫蘆素B標準曲線Fig.1 Standard curve of cucurbitacin B

圖2 超聲對得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.2 超聲波輔助提取對葫蘆素B得率的影響

野西瓜藤中葫蘆素B的含量為0.198 mg/g,低于甜瓜蒂和天花粉中的葫蘆素B含量,但是野西瓜藤的生物產量是果實的20～300倍,所以野西瓜藤是葫蘆素B的良好來源。圖2比較超聲波輔助提取對葫蘆素B得率的影響,處理的料液比為1∶10、溫度為60 ℃條件下,用70%乙醇提取20 min,超聲處理顯著增加葫蘆素B的得率,達到未超聲處理的5倍。原因在于超聲波的空化作用、熱效應、機械作業加速細胞壁的破碎使胞外溶劑容易進入細胞內[17],從而促進葫蘆素B溶出,得率提高。

2.3 料液比對葫蘆素B得率的影響

圖3為料液比對葫蘆素B得率的影響,葫蘆素B得率隨著料液比的增大而增加,得率從48.9%上升到62.3%,這是由固、液相之間的濃度差而決定的。料液少,兩相間的濃度差小,從而傳質推力小,隨著溶劑的增加,導致傳質推力的提高,使得率上升,但從顯著性分析來看,1∶14與1∶16差異不顯著(p>0.05),因此從生產成本考慮料液比1∶14為宜。

圖3 料液比對得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.4 超聲溫度對葫蘆素B得率的影響

圖4為超聲溫度對葫蘆素B得率的影響,結果顯示野西瓜藤中葫蘆素B的得率隨著超聲溫度增大而增加,從43.2%上升至在80 ℃時為54.8%達到最大值。這是由于溫度升高,溶液內分子運動劇烈,反應速率增大,導致得率的增加,在80 ℃時,得率最大,考慮到超聲儀器的實際承受能力(最大為90 ℃),選擇80 ℃為最佳提取溫度。

圖4 超聲溫度對得率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.5 乙醇體積分數對葫蘆素B得率的影響

如圖5,結果表明,在實驗范圍內,葫蘆素B得率隨著乙醇體積分數的增加而增大,得率從40.6%上升至65.6%,且在乙醇體積分數為90%時,提取液中葫蘆素B含量最高,提取效果最佳。

圖5 乙醇體積分數對得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.6 超聲時間對葫蘆素B得率的影響

圖6可以看出,葫蘆素B的得率隨著超聲時間的增加而逐漸增大,從52.56%上升至63.42%并在30 min時的得率為63.42%達到最大值,這可能是由于隨著超聲時間的延長,樣品中大部分葫蘆素B溶于乙醇中,從而使得得率逐漸增大。因此,選取30 min為葫蘆素B的最佳提取時間。

圖6 超聲時間對得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of Cucurbitacin B

2.7 回歸模型的建立及統計分析

響應面優化實驗結果見表1。采用軟件Design-Expert8.0對所得數據進行回歸分析,分析結果見表2。

表1 Design-Export實驗設計結果

Table 1 Experiment result of Design-Export

實驗號ABC葫蘆素B得率(%)100040632000530630005061401-16948510144026011887570-1150148-1-105460910-13931101-104544110005582120-1-1564313-110460914-10-1440915-1014763161106581170005107

表2 擬合二次多項式模型的方差分析

Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

項目平方和df均方F值p值模型21×10-1924×10-2113000021??A29×10-4129×10-401400710B56×10-2156×10-2266200013?C78×10-3178×10-337600930AB32×10-2132×10-2154000057?AC32×10-5132×10-5001600090??BC22×10-2122×10-2105700140?A258×10-2158×10-2278600012??B239×10-2139×10-2188100034??C219×10-3119×10-309603600殘差15×10-2720×10-3失擬項13×10-2343×10-3122501700誤差14×10-3435×10-4總離差23×10-116

由方差分析表2可以看出模型的p=0.0021<0.01,說明該模型極顯著,因此,這種實驗方法是可靠的。方差的失擬項表現不顯著p=0.1700>0.05,說明表面模型回歸擬合較好各因素值與響應值之間的關系可以用此模型來函數化,決定系數R2=0.9747說明葫蘆素B提取量的結果與模型回歸值有較好的一致性[18]。由表2中模型系數的顯著性檢驗數據可知,超聲溫度的一次項對葫蘆素B得率的影響達到顯著水平(p<0.05),二次項的影響呈現極顯著水平(p<0.01),乙醇體積分數的一次項均未達到顯著水平,而乙醇體積分數的二次項則達極顯著水平(p<0.01)。A與B交互作用顯著,B與C交互作用顯著,A和C交互關系極顯著,表明各影響因素與響應值的關系中,二次項和交互項對響應值有影響。由F值可知,各因素對葫蘆素B提取得影響排序為超聲溫度(B)>超聲時間(C)>乙醇體積分數(A)。各因素對葫蘆素B得率的影響不是簡單的線性關系,利用軟件對表1中實驗數據進行多元回歸分析,得到各因子對葫蘆素B得率影響的二次回歸模型:

Y=50.22+0.27A+7.96B+2.63C-7.22AB-0.28AC+0.64BC-9.83A2-1.25B2+3.36C2

式(1)

由響應面模型繪制出響應面分析圖,圖7可以看出,當乙醇體積分數一定時,隨著超聲時間的增大葫蘆素B的得率呈逐漸上升的趨勢;當超聲時間不變時,葫蘆素B得率隨著乙醇體積分數增加而增大。由Design-Expert 軟件對二次項回歸方程進行求解,可得藥西瓜蔓中葫蘆素B得率的優化值為:超聲溫度為79.37 ℃、超聲時間為29.51 min、乙醇體積分數74.54%,葫蘆素B得率為81.4%。為方便實驗操作將最優化條件取整數為:超聲溫度80 ℃、超聲時間30 min、乙醇體積分數75%,在此條件下,葫蘆素B的提取量為0.168 mg/g,得率為84.7%。

圖7 乙醇體積分數與超聲時間對響應值的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature and time on extraction rate of Cucurbitacin B

3 結論

研究以葫蘆素B得率為響應值,通過單因素實驗及響應面分析法探究野西瓜藤中葫蘆素B的最佳提取工藝,結果顯示超聲處理溫度對葫蘆素B得率影響最大,其次是乙醇體積分數和超聲時間,當超聲溫度80 ℃、超聲時間30 min、乙醇體積分數75%時,葫蘆素B得率最高,可以達到84.7%。因此最佳提取條件為:超聲溫度80 ℃、超聲時間30 min、乙醇體積分數75%,在此條件下,葫蘆素B得率為84.7%,提取量為0.168 mg/g。

[1]王莉梅,姚銘. 葫蘆素類化合物含量測定方法的研究進展[J]. 中國生化藥物雜志,2015(1):185-188.

[2]么煥開,劉普,王菊. 葫蘆素的研究概況[J]. 齊魯藥事,2005,24(12):738.

[3]Chen JC,Chiu MH,Nie RL,et al. Cucurbitacins and cucurbitane glycosides:structures and biological activities[J]. Natural product reports,2005,22(3):386-399.

[4]楊凱,鄭剛. 葫蘆素BE的藥理作用研究進展[J]. 國際中醫中藥雜志,2006,28(1):27-29.

[5]Alghasham A A. Cucurbitacins-a promising target for cancer therapy[J]. International journal of Health Sciences(Qassim),2013,7(1):77-89.

[6]彭朝霞,曹敏,張運杰,等. HPLC測定天花粉中葫蘆素B的含量[J].中國現代應用藥學雜志,2009,26(11):946-948.

[7]姚三桃,王苔琴. 天花粉商品的理化鑒別[J].中國中藥雜志,1992,17(4):201-202.

[8]李悅,承偉,鄒艾岑. 瓜蒂中葫蘆素B的不同提取工藝研究[J]. 中國藥房,2012,23(19):1760-1761.

[9]范宏,鄒德靜,隋秀琴,等. 超聲波輔助提取甜葫蘆中葫蘆素B的工藝研究[J]. 農產品加工,2013,(12):29-31.

[10]單海峰,唐嵐,李樂,等. 甜瓜蒂中葫蘆素B提取工藝研究[J].食品科技,2010,35(5):219-221.

[11]黃輝,張峻沛,張彥福. 維吾爾藥苦西瓜本草考證及生藥鑒定[J].中國民族民間醫藥雜志,1997,(28):35-38.

[12]周秋鴻,李東,徐穎. 藥西瓜對小腸功能的影響[J].中醫藥信息雜志,2001,18(3):25-27.

[13]龔小妹,王碩,周小雷,等. 西瓜藤的化學成分研究(Ⅱ)[J].中藥材,2013,36(10):1614-1616.

[14]吳軍俠,趙紅霞. 高效液相色譜法測定甜瓜蒂中葫蘆素B含量[J].化學與生物工程,2010,27(1):92-94.

[15]張君萍,侯喜林,董海艷,等. 響應曲面法優化超聲波提取沙蔥籽多糖工藝[J]. 食品科學,2011,32(2):98-103.

[16]孔濤,范杰平,胡小芳,等. 響應面法優化超聲輔助提取車前草中的熊果酸[J]. 食品科學,2011,32(6):80-84.

[17]張曄,趙晶晶,王鍇,等. 超聲波輔助提取辣椒紅色素[J]. 食品研究與開發,2011,32(1):71-74.

[18]邱遠,芮昕,謝翌冬,等. 響應面法優化超聲提取葛根素工藝[J]. 食品科學,2014,35(6):1-5.

Optimization of ultrasonic-assisted extraction of cucurbitacin B from watermelon(Citrulluscolocynthis)vine

ZHAO Chun-yan1,LIU Yu-ying1,2,MA Yue2,ZHAO Xiao-yan2,ZHANG Chao2,*

(1.College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China;2.Beijing Vegetable Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences;Beijing Key Laboratory of Fruitsand Vegetable Storage and Processing;Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops(North China), Ministry of Agriculture;Key Laboratory of Urban Agriculture(North),Ministry of Agriculture,Beijing 100097,China)

CucurbitacinBwasextractedfromwatermelon(Citrullus colocynthis)vinesbytheultrasonic-assistedextraction.Theultrasonic-assistedextractionwasoptimizedbythecombinationofthesingle-factorexperimentandresponsesurfacemethodology.TheresultsshowedthattheultrasonictemperaturewasthekeyfactoraffectingthecucurbitacinBextractionrate,whiletheethanolconcentrationandultrasonictimeshowedlessinfluenceontheextractionrate.TheextractionrateofthecucurbitactinBreachedto84.7%whentheethanolconcentrationwas75%withtheultrasonictemperatureof80 ℃for30min.

Citrullus colocynthis;vine;ultrasound-assistedextraction;cucurbitacinB;responsesurfacemethodology

2016-03-21

趙春燕(1966-)，女，博士，副教授，研究方向：農產品深加工，E-mail:zhaochunyan108@163.com。

*通訊作者:張超(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：果蔬深加工，E-mail:zhangchao@nercv.org。

現代農業產業技術體系建設專項資金(CARS-26)；北京市農林科學院科技創新能力建設專項(KJCX20140204)；果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室專項(Z141105004414037)。

TS217.1

B

1002-0306(2016)19-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.030