超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物工藝的研究

俞 堅

(杭州職業技術學院,杭州市綠色精細化工研究與技術轉化重點實驗室,浙江杭州 310018)

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超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物工藝的研究

俞 堅

(杭州職業技術學院,杭州市綠色精細化工研究與技術轉化重點實驗室,浙江杭州 310018)

本文研究了用超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物的工藝。考察乙醇體積分數、液料比、萃取功率和時間等因素對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響。在單因素實驗的基礎上利用Box-Behnken實驗設計方法和響應曲面分析法,確定其較優萃取工藝條件。實驗結果表明,當乙醇體積分數80%、液料比22∶1 mL/g、萃取功率563 W和萃取時間4.2 min時,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率達44.7 mg/g。

超聲波-微波協同萃取,水芹葉,黃酮類化合物,響應曲面優化

水芹(OenantheJavanica),又名蜀芹、野芹菜等,是傘形科水芹屬多年生濕生草本植物,資源十分豐富,廣泛分布于浙江、安徽、江蘇和江西等省。張儉等[1]學者研究發現,水芹中含有多種大量的黃酮類化合物、氨基酸、揮發油和水芹素等。水芹黃酮類化合物因具有獨特的生物學功效,故受到許多學者關注和開發。何文兵等[2]學者利用超聲波提取野生水芹總黃酮,發現水芹總黃酮對羥自由基具有較強的清除能力,且具有很好的抑制油脂氧化功效。Yang等[3]學者研究發現水芹黃酮類化合物具有抗糖尿病功效。水芹作為我國特色水生蔬菜,在加工過程中人們習慣于將其莖用于入菜,大量的水芹葉被直接丟棄而造成資源浪費和環境污染。如果能充分利用水芹葉,可產生較為可觀的經濟效益和社會效益,對水芹資源的深加工也具有重要意義。

近年來,關于現代萃取工藝技術研究很多,包括超臨界法[4]、超聲波法[5]、微波法[6]、加壓溶劑法[7]、超高壓法[8]、酶法[9]和超聲波-微波協同萃取法[10]等。但是,目前對水芹葉中黃酮類化合物的研究較少,尚沒有關于超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物的研究報道。超聲波-微波協同萃取法在功能性成分制取上已顯露出省時、節能和高效等優點。本文利用超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物,以期為水芹的深加工和水芹葉總黃酮類化合物的萃取工藝提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水芹 杭州市高沙農貿市場,取水芹葉低溫烘干后粉碎,過80目標準篩。蘆丁標準品美國sigma公司;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑 分析純,華東醫藥有限公司。

CW-2000超聲-微波協同萃取/反應儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;BT124S 萬分之一電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;紫外-可見分光光度計UV-2550 島津企業管理(中國)有限公司;DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海益恒實驗儀器有限公司;興易Φ100 mm布氏漏斗,唐山市開平盛興化學瓷廠;淘福CX-100小型粉碎機,上海緣沃工貿有限公司;潔盟JP-020B,深圳市潔盟清洗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水芹葉總黃酮類化合物標準曲線的測定 采用蘆丁標準品作為水芹葉總黃酮類化合物的對照品,通過硝酸鋁絡合分光光度法測定水芹葉總黃酮類化合物的含量[11]。稱取蘆丁標準品28.0 mg,用80%乙醇定容至50.0 mL,作為標準母液備用。取10.0 mL具塞試管,分別加入標準母液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,用80%乙醇補足至5.0 mL。在具塞試管加入0.30 mL 5% NaNO2,混勻后靜置5 min;在具塞試管加入0.30 mL 10% Al(NO3)3,混勻后靜置6 min;在具塞試管加入4.0 mL 1 mol/L NaOH,在具塞試管加入0.40 mL 80%乙醇,混勻后靜置10 min;于510 nm處測定其吸光光度值。由測定結果得水芹葉總黃酮類化合物標準曲線方程A510 nm=4.637C+0.007(A:吸光光度值;C:質量濃度,mg/mL;R2=0.998)

1.2.2 水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的測定 取水芹葉粉1.000 g,經超聲波-微波協同萃取后,萃取液減壓抽濾,移置50.0 mL容量瓶中用80%乙醇定容,精確移取1.0 mL定容液,采用硝酸鋁絡合分光光度法測定水芹葉總黃酮類化合物的含量,根據標準曲線方程計算水芹葉總黃酮類化合物的質量濃度,再由質量濃度計算水芹葉總黃酮類化合物的萃取得率。R=500×C/M×100%。式中:R為水芹葉總黃酮類化合物的萃取得率(mg/g);C為水芹葉總黃酮類化合物的質量濃度(mg/mL);M為水芹葉質量(g)。

1.2.3 單因素實驗設計依據前期預實驗的結果 取水芹葉粉在不同乙醇體積分數和不同液料比下,設定超聲波-微波協同萃取功率和萃取時間,改變其中一個因素,進行單因素實驗。各因素梯度設計為:乙醇體積分數20%、40%、60%、80%和100%;液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g;萃取功率200、300、400、500、600 W;萃取時間2、4、6、8、10 min。

1.2.4 響應曲面實驗設計 依據超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物的單因素實驗結果,采用Box-Behnken設計方案[12]進行超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物的響應曲面研究。四個自變量乙醇體積分數、液料比、萃取功率和萃取時間分別以A、B、C和D表示,以+1,0,-1分別代表各自的不同水平,編碼因素及水平、實驗設計方案見表1。

表1 Box-Behnken設計方案的因素及水平

Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

因素因素-10+1乙醇體積分數(%)406080液料比(mL/g)15∶120∶125∶1萃取功率(W)400500600萃取時間(min)246

1.2.5 萃取方法比較 取水芹葉粉1.000 g,加入22 mL 80%乙醇,經563 W超聲波萃取30 min后,萃取液減壓抽濾,移置50.0 mL容量瓶中用80%乙醇定容,精確移取1.0 mL定容液,測定超聲波水芹葉總黃酮類化合物萃取得率;取水芹葉粉1.000 g,加入22 mL 80%乙醇,經563 W微波萃取4.2 min后,萃取液減壓抽濾,移置50.0 mL容量瓶中用80%乙醇定容,精確移取1.0 mL定容液,測定微波水芹葉總黃酮類化合物萃取得率;與超聲波-微波協同萃取技術進行比較分析。

1.3 數據處理與分析

超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物的響應曲面實驗數據采用Design Expert 8.0軟件繪圖,并做方差和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 乙醇體積分數對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響 由圖1可知,超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物,隨著乙醇體積分數從20%提高到80%,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率不斷提高;當乙醇體積分數達到80%后,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率反而降低。可以初步推斷,在超聲波-微波協同萃取條件下,合適的乙醇體積分數有利于水芹葉總黃酮類化合物從葉粉中溶出。超聲波-微波協同萃取時,若乙醇體積分數過高,不僅增大乙醇使用成本,增加其他雜質的溶出。所以,選擇40%～80%乙醇體積分數作為響應曲面優化考察范圍。

圖1 乙醇體積分數對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids from Oenanthe Javanica leaves

2.1.2 液料比對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響 由圖2可知,超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物,隨著液料比從10∶1 mL/g提高到20∶1 mL/g,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率不斷提高;當液料比達到20∶1 mL/g后,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率變化趨緩,反而略有降低。可以初步推斷,在超聲波-微波協同萃取條件下,合適的液料比有利于水芹葉總黃酮類化合物從水芹葉中溶出。超聲波-微波協同萃取時,若萃取溶劑使用過多,不僅增大溶劑使用成本,增加其他雜質的溶出,而且還會大大增加下游減壓濃縮的能耗。所以,選擇15∶1 mL/g至25∶1 mL/g液料比作為響應曲面優化考察范圍。

圖2 液料比對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of flavonoids from Oenanthe Javanica leaves

2.1.3 萃取功率對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響 由圖3可知,超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物,隨著萃取功率從200 W到500 W,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率逐漸提高。當萃取功率到500 W后,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率變化趨緩,反而略有降低。可以初步推斷,在較高的萃取功率下有利于水芹葉總黃酮類化合物的提取。另一方面,當萃取功率過高,可能會造成水芹葉總黃酮類化合物的破壞。所以,選擇400 W至600 W萃取功率作為響應曲面優化考察范圍。

圖3 萃取功率對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響Fig.3 Effect of treatment power on extraction rate of flavonoids from Oenanthe Javanica leaves

2.1.4 萃取時間對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響 由圖4可知,超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物,隨著萃取時間從2～4 min,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率逐步提高。當萃取時間超過4 min后,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率趨于緩慢。可以初步推斷,在超聲波-微波協同萃取下可以極大地縮短水芹葉總黃酮類化合物的萃取時間,萃取效率相當高。當萃取時間超過4 min后,水芹葉總黃酮類化合物萃取液達到飽和,再延長萃取時間也無明顯效果;但是若萃取時間過長,會增加超聲波-微波設備的機械損傷,從而提高設備的使用和維護費用。所以,選擇2 min至6 min萃取時間作為響應曲面優化考察范圍。

圖4 萃取時間對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of flavonoids from Oenanthe Javanica leaves

2.2 響應曲面實驗結果與分析

以A乙醇體積分數(%)、B液料比(mL/g)、C萃取功率(W)和D萃取時間(min)為自變量,R水芹葉總黃酮類化合物萃取得率(mg/g)為響應值,進行響應曲面優化實驗,結果詳見表2。

表2 響應曲面優化實驗結果

Table 2 Program and results of Response Surface Analysis

實驗號A(%)B(mL/g)C(W)D(min)R(mg/g)實驗號A(%)B(mL/g)C(W)D(min)R(mg/g)14015∶15004251156015∶1600431728015∶15004370166025∶1600435434025∶15004264174020∶1400427748025∶15004414188020∶1400432856020∶14002258194020∶1600426666020∶16002347208020∶1600441276020∶14006267216015∶1500230186020∶16006350226025∶1500234894020∶15002256236015∶15006312108020∶15002407246025∶15006356114020∶15006266256020∶15004370128020∶15006419266020∶15004379136015∶14004225276020∶15004373146025∶14004266

表3 響應曲面優化實驗結果的方差分析

Table 3 Analysis of variance for response surface regression equation

來源平方和自由度均方F值Prob>F顯著性模型850491460751791<00001顯著A4940814940814570<00001顯著B425614256125500040C150521150524439<00001顯著D234123406904223AB240124007104164AC22561225666500241AD1000E-00211000E-0022949E-00309576BC004010040001209153BD0022100226635E-00309364CD009010090002708733A210021100229601112B2570615706168300015C2115731115733413<00001顯著D219421194257300339殘差406912339失擬項402710403191800506不顯著純誤差0422021總差8911826

用Design Expert 8.0軟件對表2數據進行多元回歸擬合,得到水芹葉總黃酮類化合物萃取得率對乙醇體積分數、液料比、萃取功率和萃取時間的二次多項回歸方程是:

R=37.40+6.42A+1.88B+3.54C+0.44D+0.78AB+2.38AC+0.050AD-0.10BC-0.075 BD-0.15CD-1.37A2-3.27B2-4.66C2-1.91D2

由表3知,乙醇體積分數和萃取功率的一次項均達到顯著水平(p<0.0001),整體模型的Prob>F值<0.0001,表明二次多項回歸方程模型達到極顯著水平,并且失擬項不顯著,說明該回歸方程對超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物實驗擬合較好。

圖5～圖10反映了超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物,乙醇體積分數、液料比、萃取功率和萃取時間等四因素三水平兩兩交互的影響。

由圖5～圖7可知,乙醇體積分數和液料比交互作用中,沿乙醇體積分數A軸的變化較沿液料比B軸的變化密集,所以乙醇體積分數對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率R值面積的影響更大;乙醇體積分數和萃取功率交互作用中,沿乙醇體積分數A軸的變化較沿萃取功率C軸的變化密集,所以乙醇體積分數對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率R值面積的影響更大;乙醇體積分數和萃取時間交互作用中,沿乙醇體積分數A軸的變化較萃取時間D軸的變化密集,所以乙醇體積分數對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率R值面積的影響更大。

圖5 乙醇體積分數和液料比對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率影響的響應曲面圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on flavonoids from Oenanthe Javanica leaves extraction rate

圖6 乙醇體積分數和萃取功率對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率影響的響應曲面圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effect of ethanol concentration and treatment power on flavonoids from Oenanthe Javanica leaves extraction rate

圖7 乙醇體積分數和萃取時間對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率影響的響應曲面圖Fig.7 Response surface plot showing the interactive effect of ethanol concentration and extraction time on flavonoids from Oenanthe Javanica leaves extraction rate

圖8 液料比和萃取功率對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率影響的響應曲面圖Fig.8 Response surface plot showing the interactive effect of liquid-solid ratioand treatment power on flavonoids from Oenanthe Javanica leaves extraction rate

圖9 液料比和萃取時間對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率影響的響應曲面圖Fig.9 Response surface plot showing the interactive effect of liquid-solid ratioand extraction timeon flavonoids from Oenanthe Javanica leaves extraction rate

圖10 萃取功率和萃取時間對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率影響的響應曲面圖Fig.10 Response surface plot showing the interactive effect of treatment power and time on flavonoids from Oenanthe Javanica leaves extraction rate

由圖8～圖10可知,液料比和萃取功率交互作用中,沿液料比B軸的變化較萃取功率C軸的變化稀疏,所以萃取功率對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率R值面積的影響更大;液料比和萃取時間交互作用中,沿液料比B軸的變化較沿萃取時間D軸的變化密集,所以液料比對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率R值面積的影響更大;萃取功率和萃取時間交互作用中,沿萃取功率C軸的變化較萃取時間D軸的變化密集,所以萃取功率對水芹葉總黃酮類化合物萃取得率R值面積的影響更大。

2.3 工藝優化與驗證實驗

對超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物回歸方程求導,令水芹葉總黃酮類化合物萃取得率R值等于零,得到響應曲面的最大值,即乙醇體積分數、液料比、萃取功率和萃取時間四因素的最佳水平值,最后獲得超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物的最佳條件是:乙醇體積分數80%、液料比22∶1 mL/g、萃取功率563 W和萃取時間4.2 min,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率達44.9 mg/g。實驗實際測定此優化工藝條件下,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率為44.7 mg/g。表明優化的超聲波-微波協同萃取工藝參數科學合理,并且結果可靠。

2.4 萃取方法比較

由圖11可知,在相同乙醇體積分數和液料比的條件下,采用超聲波法萃取水芹葉總黃酮類化合物,萃取得率僅為27.3 mg/g;采用微波輔助法萃取水芹葉總黃酮類化合物,萃取得率也僅為35.1 mg/g,都顯著低于超聲波-微波協同萃取法。因此,超聲波-微波協同萃取法是一種節能、高效的現代萃取技術。

圖11 萃取方法比較Fig.11 The comparison of extraction methods

3 結論與討論

通過超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物響應曲面尋優實驗,結果表明,當乙醇體積分數80%、液料比22∶1 mL/g、萃取功率563 W和萃取時間4.2 min時,水芹葉總黃酮類化合物萃取得率達44.7 mg/g。超聲波-微波協同萃取技術在相同乙醇體積分數和液料比的條件下,要優于超聲波萃取法和微波輔助萃取法。本研究采用超聲波-微波協同萃取工藝技術,本質上是利用超聲波-微波協同效應,強化水芹葉總黃酮類化合物的潤濕、溶解和擴散等傳質過程。利用超聲波的機械粉碎作用和空化效應[13],以及微波在水芹葉內部微組織結構熱效應[14]的協同下,減少了傳質阻力,提高了擴散常數,從而強化了黃酮類化合物從水芹葉粉擴散到乙醇提取液的傳質過程。超聲波-微波協同萃取水芹葉總黃酮類化合物與傳統提取工藝相比,克服了傳統工藝提取時間長、液料比較高、萃取得率低等不足,具有萃取得率高、速度快、污染小等優點,符合水芹的深加工和水芹葉總黃酮類化合物工業現代化生產技術的發展方向。

[1]張儉,李勝華,谷榮輝.水芹的化學成分研究[J].中草藥,2012(7):1289-1292.

[2]何文兵,夏光輝,劉歡,等.野生水芹總黃酮提取工藝優化及抗氧化活性[J].北方園藝,2015(1):122-127.

[3]Yang XB,Huang ZM,Cao WB,et al.Antidiabetic effect of Oenanthe javanica flavone [J].Acta Pharmacologica Sinica,2000,21(3):239-242.

[4]Chu Chu,Shidi Zhang,Shengqiang Tong,et al.An efficient strategy for the extraction and purification of lignans from Schisandra chinensis by a combination of supercritical fluid extraction and high-speed counter-current chromatography[J]. Journal of Separation Science,2013,36(24):3958-3964.

[5]Min Shi,Yingnan Yang,Xuansheng Hu,et al.Effect of ultrasonic extraction conditions on antioxidative and immunomodulatory activities of a Ganoderma lucidum polysaccharide originated from fermented soybean curd residue[J].Food Chemistry,2014,155:50-56.

[6]Tuyen C,KhaMinh H,NguyenDong T,et al.Stathopoulos.

Optimization of microwave-assisted extraction of Gac oil at different hydraulic pressure,microwave and steaming conditions[J].International Journal of Food Science & Technology,2013,48(7):1436-1444.

[7]俞堅.響應面分析優化加壓溶劑法提取甜菊糖苷工藝[J].食品研究與開發,2014 (7):43-47.

[8]Jae-Sung Shin,Soon-Cheol Ahn,Sung-Won Choi,et al.Ultra high pressure extraction (UHPE) of ginsenosides from Korean Panax ginseng powder[J].Food Science and Biotechnology,2010,19(3):743-748.

[9]Qinghong You,Xiulian Yin,Yuping Zhao.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit of Cornus officinalis[J].Carbohydrate Polymers,2013,98(1):607-610.

[10]Xin Liu,Yan Hu,Dongfeng Wei.Optimization of enzyme-based ultrasonic/microwave-assisted extraction and evaluation of antioxidant activity of orcinol glucoside from the rhizomes of Curculigo orchioides Gaertn [J].Medicinal Chemistry Research,2014,23(5):2360-2367.

[11]陳況況,帕塔爾尼牙孜,章宏慧,等. 響應面法優化水芹黃酮提取工藝及其成分研究[J]. 中國食品學報,2014(11):83-89.

[12]Mahmoud Yolmeh,Mohammad B. Habibi Najafi,Reza Farhoosh. Optimization of ultrasound-assisted extraction of natural pigment from annatto seeds by response surface methodology (RSM)[J].Food Chemistry,2014(155):319-324.

[13]Satoshi TAMURA,Yoshiki TSUNEKAWA,Masahiro OKUMIYA.Effect of Ultrasonic Cavitation on Force Acting on Solid Object in Water[J].Japanese Journal of Applied Physics,2006,45(4A):2842-2844.

[14]X. Q. Yang,K. M. Huang,H. C. Zhu,et al.The analysis of “power window” induced by thermal effect during the microwave heating[J].Russian Journal of Physical Chemistry AFocus on Chemistry,2012,86(1):81-84.

Study on ultrasonic and microwave-assisted extraction of flavonoids fromOenantheJavanicaleaves

YU Jian

(Hangzhou Vocational and Technical College,Hangzhou Key Laboratory of Green Fine Chemicals Research and Technological Transformation,Hangzhou 310018，China)

Thetechnologyofultrasonicandmicrowave-assistedextractionofflavonoidsfromOenanthe Javanicaleaveswasstudied.Theexperimentsinvestigatedtheeffectsofextraction,suchasethanolconcentration,liquid-solidratio,treatmentpowerandextractiontime.TheexperimentswereoptimizedusingaBox-Behnkenmethodoftestdesignandresponsesurfacemethodologyonthebasisofthesinglefactorexperiment.Testresultsshowedthatwhentheethanolconcentrationwas80%andliquid-solidratiowas22∶1mL/g,treatmentpower563Wextractionandextractiontimeof4.2min,theextractionyieldofflavonoidsfromOenanthe Javanicaleaveswasupto44.7mg/g.

Ultrasonicandmicrowave-assistedextraction;OenantheJavanicaleaves;flavonoids;ResponseSurfaceAnalysis

2016-03-18

俞堅(1981-)，男，碩士研究生，高校講師，主要研究現代食品加工技術，E-mail:4610483@qq.com。

浙江省教育廳科研資助項目(Y201326615)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)19-0206-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.032