上海市售水產品中副溶血性弧菌耐藥性分析

盧 奕,陳瑋祎,劉海泉，2，3，*,謝 晶，2，3,趙 勇，2，3，*,孫曉紅，2，3

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306; 3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)

?

上海市售水產品中副溶血性弧菌耐藥性分析

盧 奕1,陳瑋祎1,劉海泉1，2，3，*,謝 晶1，2，3,趙 勇1，2，3，*,孫曉紅1，2，3

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306; 3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)

為了解上海市售水產品中副溶血性弧菌的耐藥情況,通過藥敏紙片擴散法(K-B法)對上海市某水產品市場連續兩年監測分離獲得的45株副溶血性弧菌進行了25種常用抗生素的藥敏實驗。結果顯示,所有實驗菌株都對青霉素G和甲硝唑耐藥,有高達90%以上的菌株對帕拉西林、新霉素和卡那霉素耐藥,而對利福平、萬古霉素、四環素、強力霉素、頭孢拉定和土霉素全部敏感;同時發現不同來源的菌株,其耐藥譜存在一定程度的差異,菌株多重耐藥性與菌株致病因子類型間也存在一定的相關性。因此,應進一步加強水產品中細菌耐藥性的監測,并采取更有效措施控制細菌耐藥性。

水產品,副溶血性弧菌,耐藥性

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)屬于弧菌科弧菌屬,是一種革蘭氏陰性菌,嗜鹽[1]。副溶血性弧菌不僅是水產養殖中常見的病原菌,同時也是引起沿海地區食物中毒的主要食源性致病菌[2]。生食或未充分烹飪被副溶血性弧菌污染的食品(主要為水產品)是導致食物中毒的主要原因[3]。據國家衛生和計劃生育委員會統計,2015年微生物性食物中毒事件的中毒人數最多,副溶血性弧菌為主要致病因子之一[4]。通過對上海市市售食品中食源性致病菌污染狀況的調查,結果表明74.84%的食品安全事件由微生物導致,其中副溶血性弧菌導致的食物中毒事件占到微生物因素的33.33%[5],可見副溶血性弧菌在我國仍是主要的食源性致病菌。

溶血毒素是副溶血性弧菌的主要致病因子;溶血毒素主要有耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)、耐熱直接溶血素相關溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH)及不耐熱溶血素(hermolabilehemolysin,TLH);其中TDH和TRH是與副溶血性弧菌致病性密切相關的毒力因子[6]。抗生素是由微生物或高等動植物在生活過程中所產生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產物,能干擾其他生活細胞發育功能的化學物質[7]。目前,主要使用抗生素來預防和控制副溶血性弧菌引發的病害,但抗生素的不正確使用使副溶血性弧菌更容易獲得耐藥性,并且其耐藥性可通過食物鏈轉移給人類[8]。

因此,為監測水產品中副溶血性弧菌的耐藥性狀況,本研究從上海市某水產品市場連續兩年采集并分離得到45株副溶血性弧菌,選取了6大類25種藥敏片,分別從菌株分離來源、致病因子類型等角度分析其耐藥情況,為控制副溶血性弧菌耐藥性、指導抗生素的合理使用提供一定的基礎數據,從而更好地控制副溶血性弧菌對人類和水產動物的危害。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽蔗糖瓊脂(TCBS瓊脂) 購于北京陸橋技術股份有限公司;Mueller Hinton肉湯、藥敏片 購于英國OXOID公司。

VS-100L-U超凈工作臺 江蘇蘇凈集團;MLS-3750型壓力蒸汽滅菌器、MIR-154型高精度低溫培養箱 日本三洋Sanyo公司;6325型聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀、5424型離心機、微量移液器 德國Eppendorf公司;PL2002型電子天平瑞士Mettler Toledo公司;Sub-Cell?GT型電泳儀、Gel DocTMXR型凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

從上海市某水產品市場連續兩年分離得到45株副溶血性弧菌,以及從食用了被該菌污染的食品或者食用了含有該菌的食品后出現中毒癥狀的病人分離到的2株副溶血性弧菌,作為對照,詳見表1。抗菌素敏感實驗質控標準菌株大腸埃希氏菌ATCC25922。

表1 副溶血性弧菌菌株基本信息

Table 1 Informations ofVibrioparahaemolyticusstrains

菌株編號菌株分離來源致病基因tlhtdhtrh1斑節對蝦+--2日本沼蝦++-3基尾蝦+--4日本沼蝦+--5日本沼蝦+--6日本沼蝦+--7羅氏沼蝦+--8斑節對蝦+--9羅氏沼蝦+--10斑節對蝦+--11日本沼蝦+--12羅氏沼蝦+--13斑節對蝦+--14羅氏沼蝦+--15斑節對蝦+--16羅氏沼蝦+--17日本沼蝦+--18日本沼蝦++-19斑節對蝦+--20日本沼蝦+--21斑節對蝦+-+22羅氏沼蝦+--23白米蝦+--24羅氏沼蝦+-+25羅氏沼蝦+-+26羅氏沼蝦+-+27羅氏沼蝦+-+28羅氏沼蝦+-+29羅氏沼蝦+-+30羅氏沼蝦+-+31南美白對蝦+--32羅氏沼蝦+--33羅氏沼蝦+-+34羅氏沼蝦+-+35南美白對蝦+--36南美白對蝦+--37南美白對蝦+--38南美白對蝦+--39南美白對蝦++-40南美白對蝦++-41南美白對蝦++-42南美白對蝦++-43南美白對蝦++-44南美白對蝦++-45南美白對蝦++-46?病人+++47?病人+++

注:+含有該基因,-不含有該基因;*菌株46和47,作為對照菌株。1.2 實驗方法

1.2.1 樣品中副溶血性弧菌的鑒定 根據GB/T 4789.7-2013《食品衛生微生物學檢驗:副溶血性弧菌檢驗》方法[9],分離獲得疑似副溶血性弧菌;對疑似菌株的16S rDNA測序后,通過NCBI數據庫比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),最終確定是否為副溶血性弧菌。

表2 副溶血性弧菌的耐藥性分析及耐藥菌株比例

Table 2 Analysis ofVibrioparahaemolyticusantibiotic resistance

抗生素菌株數RIS耐藥率(%)青霉素類AML(阿莫西林)142312979AMP(氨芐西林)39718298P(青霉素G)470010000PRL(帕拉西林)46109787SAM(舒巴坦/氨芐西林)2144426頭孢菌素類KF(頭孢噻吩)21827426CE(頭孢拉定)0047000氨基糖苷類S(鏈霉素)32816638N(新霉素)45119574K(卡那霉素)43409149大環內酯類E(紅霉素)0245000SP(螺旋霉素)01730000奎諾酮類CIP(環丙沙星)211884468NOR(諾氟沙星)211794468NA(萘啶酸)21431426ENR(恩諾沙星)3836638SXT(甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異惡唑)162473404其它類VA(萬古霉素)0047000MTZ(甲硝唑)470010000TE(四環素)0047000DO(強力霉素)0047000C(氯霉素)1046212RD(利福平)0047000PB(多粘菌素B)40708511OT(土霉素)0047000

注:表中R為耐藥,I為中介,S為敏感;耐藥率(%)=耐藥菌株數(R)/菌株總數×100。

1.2.2 菌液的制備 取于-80 ℃、25%甘油保存的菌種,接種于3% NaCl的TSB 肉湯,在37 ℃下復蘇后,劃線接種于3% NaCl的TSA平板,挑取單菌落接種于TSB肉湯中,在37 ℃下培養至對數期,連續活化2次。最后將副溶血性弧菌劃線接種與TCBS平板上,挑取單菌落于10 mL TBS試管中,37 ℃、180 r/min搖床培養16 h,得到OD為1.1～1.4的菌液,作為種子液,備用[10]。

1.2.3 藥敏實驗 采用WHO推薦的K-B氏紙片法[11],并參考本實驗室方法[12]:將種子液濁度調至為1.5×108CFU/mL(OD值約為0.33～0.34),用棉拭子蘸取一定量的菌液均勻涂到約4 mm厚的MHA平板,待干后,將藥敏紙片貼于平板上,重復操作五次。放置于37 ℃的恒溫培養箱中培養18 h后,測量抑菌圈直徑。藥敏實驗的質控方法和結果判定依據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)微生物敏感實驗的執行標準,以標準敏感菌株大腸桿菌ATCC 25922為質控菌。

2 結果與分析

2.1 副溶血性弧菌耐藥性概況

依據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)微生物敏感實驗的執行標準進行判定,本研究質控菌株大腸桿菌ATCC25922的藥敏實驗結果符合美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)微生物敏感實驗執行標準提供的參考數值范圍。根據藥敏片的種類,副溶血性弧菌耐藥性整體概況如表2所示。所有實驗菌株均耐青霉素G和甲硝唑,有高達90%以上的菌株對帕拉西林、新霉素和卡那霉素耐藥,而對利福平、萬古霉素、四環素、強力霉素、頭孢拉定和土霉素全部敏感。

2.2 菌株耐藥性與菌株分離來源的關聯分析

結果表明不同分離來源的副溶血性弧菌對17種抗生素表現出不同程度的耐藥性(見圖1)。其中從羅氏沼蝦中分離得到的16株副溶血性弧菌對15種抗生素產生了耐藥性;來源于南美白對蝦的12株對15種抗生素耐藥;來源于斑節對蝦的7株對14種抗生素耐藥;來源于日本沼蝦的8株對13種抗生素耐藥;來源于白米蝦的1株11種抗生素耐藥;來源于基尾蝦的1株對8種抗生素耐藥;來源于病人的2株對9種抗生素耐藥;分離自羅氏沼蝦副溶血性弧菌的耐藥譜最復雜,分離來源于基尾蝦的菌株耐藥譜相對簡單。且所有來源的菌株對青霉素G、甲硝唑、帕拉西林、新霉素、卡那霉素和氨芐西林這六種抗生素均存在不同程度的耐藥。

分離來源于南美白對蝦的副溶血性弧菌分別有83.3%和100.0%的菌株對頭孢噻吩和氯霉素產生了耐藥,而其它分離來源的菌株對這兩種抗生素普遍敏感;但對于多粘菌素B,分離來源于南美白對蝦的副溶血性弧菌卻表現為完全敏感,而其他分離來源的菌株卻表現出一定程度的耐藥。

圖1 菌株來源與耐藥性關聯分析Fig.1 Analysis on the relationship between strains isolation and antibiotic resistance

2.3 多重耐藥性分析

根據副溶血性弧菌溶血毒素致病基因不同將菌株分為四種類型:tdh+/trh-/tlh+,tdh-/trh+/tlh+,tdh+/trh+/tlh+和tdh-/trh-/tlh+[13]。由圖2可以看出tdh-/trh+/tlh+和tdh-/trh-/tlh+類型的菌株耐藥譜最復雜。菌株多重耐藥性與致病基因類型可能存在一定的關聯,其中tdh-/trh+/tlh+有促使副溶血性弧菌對更多抗生素產生耐藥性的可能。

圖2 菌株致病基因類型與多重耐藥性的關聯分析Fig.2 The strains of the pathogenic types and proportion of multi-drug resistance

2.4 Heat-map菌株耐藥分析情況

本研究使用Heat-map清晰地呈現副溶血性弧菌菌株的耐藥譜(圖3)。其對青霉素G和甲硝唑的耐藥率達到100%,但對帕拉西林、新霉素、卡那霉素和氨芐西林的抗性更強;而本研究中分離得到的副溶血性弧菌菌株對利福平、四環素、強力霉素、舒巴坦/氨芐西林和氯霉素的敏感度較高。

圖3 47株副溶血性弧菌對25種抗生素的耐藥性熱圖分析Fig.3 The antibiotic resistance heat map of 47 Vibrio parahaemolyticus strains to 25 kinds of antibiotics

菌株4與29間,5與45間,11與15間,17與23間,18與39間耐藥譜高度相似,其中菌株4、5、11、17、18均分離自日本沼蝦,而菌株15分離自斑節對蝦,23分離自白米蝦,29分離自羅氏沼蝦,39、45分離自南美白對蝦,可見分離來源于日本沼蝦的菌株與其它分離來源的菌株間出現相似性,推測可能是養殖環境所導致。

分離自日本沼蝦的菌株20與分離自病人的菌株46的耐藥譜也出現一定程度的相似性,均對青霉素類、氨基糖苷類和其它類三大類抗生素表現出較強的耐藥性。早期認為,細菌耐藥性的出現,與抗生素作用位點的點突變有關,但隨著抗生素的濫用情況日趨嚴重,點突變的發生率已無法解釋細菌多重耐藥性的普遍發生,因此,細菌可移動遺傳元件可以在同種或不同種菌株間水平轉移,成為多重耐藥性產生的主要原因[14];而從另一個角度分析,人們缺乏正確使用抗生素的意識,意大利學者的一項調查中顯示,26.9%的人不清楚抗生素的濫用會導致細菌耐藥[15]。

3 結論與討論

目前,抗生素的濫用、亂用加重了細菌耐藥性的問題,特別是由于多重耐藥菌株感染而導致死亡的報道逐年增加[16],引起了世界廣泛的關注,已成為世界性的難題[17]。食源性致病菌的耐藥性對食品安全以及人類身體健康的影響已經引起了人們的重視[18]。本研究從養殖業,醫療等領域可能使用的抗生素中選取了25種抗生素進行了耐藥性實驗,結果表明無論從水產品還是病人中分離到的副溶血性弧菌都存在一定程度的耐藥問題,且菌株耐藥譜有顯著差異,因此菌株多重耐藥性的產生具有復雜性和多樣性。

農業部對養殖中抗生素的使用有嚴格的規定,其中氯霉素、萬古霉素、頭孢噻吩、頭孢拉定和利福平均為禁用抗生素[19],實驗結果表明(表2),菌株對萬古霉素、頭孢拉定和利福平未產生耐藥性,而氯霉素的耐藥率為2.12%,出現1株耐藥、46株敏感,細菌耐藥性的出現可能是細菌自身的原因[20];頭孢噻吩的耐藥率為4.26%,出現2株耐藥、18株中介、27株敏感,可能是由于違規排放而導致養殖環境中出現該抗生素,也可能是由于養殖過程中抗生素違規使用。2015年9月1日,農業部發布2292公告,禁用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星等四種抗生素。四者都屬于第三代喹諾酮的氟喹諾酮類基本藥物,在人類醫療中占有較重地位[21]。本研究連續兩年監測結果顯示,針對NOR(諾氟沙星),47株副溶血性弧菌的耐藥情況為,21株耐藥、17株中介、9株敏感,耐藥率高達44.68%。

近來,有不少抗生素的輔助試劑相繼研發問世,也從側面反映出由于耐藥性的產生而導致抗生素的藥效下降,甚至失效等問題[22]。本研究通過連續兩年對上海某水產品市場的監測結果表明,上海市售水產品中副溶血性弧菌已經出現多重耐藥性,且不同分離來源的菌株耐藥譜存在一定的差異。及時了解掌握細菌的耐藥性情況,對指導農業和醫學領域合理應用抗生素,提高療效,維持細菌對抗生素的敏感性,減少耐藥菌株的產生具有重大意義。

[1]Honda T,Iida T. The pathogenicity ofVibrioparahaemolyticusand the role of the thermostable direct haemolysin and related haemolysins[J]. Reviews in Medical Microbiology,1993,4(2):106-113.

[2]Tran L,Nunan L,Redman R M,et al. Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp[J]. Diseases of aquatic organisms,2013,105(1):45-55.

[3]FAO/WHO. Risk assessment ofVibrioparahaemolyticusin seafood:interpretative summary and technical report[M]. Rome:Microbiological Risk Assessment Series No. 16,2011.

[4]國家衛生計生委辦公廳,關于2015年全國食物中毒事件情況的通報[EB/OL]. http://www.nhfpc.gov.cn/yjb/s7859/201604/8d34e4c442c54d33909319954c43311c.shtml,國衛辦應急發〔2016〕5號,2016-04-01.

[5]上海市食品安全委員會辦公室,上海市食品藥品監督管理局. 2014年上海市食品安全白皮書[EB/OL].http://www.shfda.gov.cn/WDSearch/search.ashx,2014-02-02.

[6]劉海泉,劉冰宣,呂利群,等. 上海市生食三文魚中副溶血性弧菌污染的風險分析[J]. 食品科學,2015,36(24):195-199.

[7]馮美珍,戴光華. 抗生素的合理應用[J]. 井岡山醫專學報,2000,7(3):33-35.

[8]Soom H,L’abee-land T M. Antibiotic resistance in food-related bacteriaa result of interfering with the global web of bacteria genetics[J]. International Journal of Food Microbiology,2002,78(1-2):43-56.

[9]GB/T 4789.7-2013,食品衛生微生物學檢驗:副溶血性弧菌檢驗[S].

[10]郭丹鳳,張昭寰,肖莉莉,等. 不同耐藥性致病性副溶血性弧菌的生長特性比較研究[J]. 食品工業科技,2014,35(19):137-141.

[11]管遠志,王艾琳,李堅. 醫學微生物學實驗技術[M]. 北京:化學工業出版社,2006,108-l15.

[12]張昭寰,郭丹鳳,王敬敬,等. 改良K-B法用于副溶血性弧菌耐藥性檢測[J]. 微生物學雜志,2014,34(1):78-83.

[13]Ma F L,Liu H Q,Wang J J,et al. Behavior ofVibrioparahemolyticuscocktail including pathogenic and nonpathogenic strains on cooked shrimp[J]. Food Control,2016,68:124-132.

[14]Siguier P,Filee J,Chandler M. Insertion sequences in prokaryotic genomes[J]. Current Opinion in Microbiology,2006,9(5):526-531.

[15]Gualano M R,Gili R,Scaioli G,et al. General population’s knowledge and attitudes about antibiotics:a systematic review and meta-analysis[J]. Pharmacoepidemiology and Drug Safety,2015,24(1):2-10.

[16]劉秀梅,陳艷,郭云昌,等. 2005年中國食源性疾病暴發事件監測資料分析[J]. 中國食品衛生雜志,2008,20(6):506-509.

[17]Neu H C. The crisis in antibiotic resistance[J]. Science,1992,257(5073):1064-1073.

[18]趙靜,孫海娟,馮敘橋. 食品中食源性致病菌污染狀況及其監測技術研究進展[J]. 食品安全質量檢測學報,2013,4(5):1353-1360.

[19]中華人民共和國農業部,中華人民共和國農業部公告第560號[EB/OL]. http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200511/t20051117_496523.htm,2005-11-01.

[20]Levy S B. Antibacterial household products:cause for concern[J]. Emerging Infectious Diseases,2001,7(3):512-515.

[21]中華人民共和國農業部,中華人民共和國農業部公告第2292號[EB/OL]. http://www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201509/t20150907_4819267.htm,2015-09-07.

[22]冉陸. 食源性致病菌及其耐藥性[J]. 預防醫學文獻信息,2001,7(5):F002-F002.

Serveillance and analysis on drug-resistance ofVibrioparahaemolyticusisolated from the commercial aquatic products in markets of Shanghai

LU Yi1,CHEN Wei-yi1,LIU Hai-quan1，2，3，*,XIE Jing1，2,3,ZHAO Yong1,2,3,*,SUN Xiao-hong1,2,3

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing & Preservation,Shanghai 201306,China; 3.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture Shanghai 201306,China)

TheaimofthisstudywastosurveyandanalyzetheantibacterialresistanceofVibrio parahaemolyticus,whichwereisolatedfromthecommercialaquaticproductsinShanghaimarkets. 45 V. parahaemolyticusstrainswereisolatedintwoyears,andalltheisolateswerecarriedoutfor25kindsofantibioticsusceptibilitypatternusingmodifiedKirby-Bauerdiskdiffusionmethod.TheresultsshowedthatallstrainswereresistancetoPenicillinGandMetronidazole.Morethan90%oftheV. parahaemolyticusisolateswereresistanttoPiperacillin,NeomycinandKanamycin,andallstrainsweresensitivetoRifampicin,Vancomyci,Tetracycline,Doxycycline,CephradineandOxytetracycline.Moreover,antibioticresistancepatternsofthestrainsexistedacertaindifferencesamongisolationorigin.Andtherewasacertainrelationbetweenthemulti-drugresistanceandpathogenictypesofthestrains.Forthisreason,itisimportanttotakemeasurestostrengthenmonitortheantibacterialresistanceofV. parahaemolyticusinthecontaminatedaquaticproducts.

aquaticproducts;Vibrio parahaemolyticus;antibioticresistance

2016-04-25

盧奕(1995- )，女，本科，研究方向：食品安全風險評估，E-mail:cindy.luyi@foxmail.com。

*通訊作者:劉海泉(1980- )，男，博士，講師，研究方向：食品安全，E-mail:hqliu@shou.edu.cn。 趙勇(1975- )，男，博士，教授，研究方向：食品安全與生物技術，E-mail:yzhao@shou.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目(31271870, 31571917，31671779)；上海市科委計劃項目(14DZ1205100，14320502100)；上海市科技興農重點攻關項目(滬農科攻字2014第3-5號、2015第4-8號、2016第1-1號)；上海市教委曙光計劃(15SG48)；上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心(11DZ2280300)。

TS254.2

A

1002-0306(2016)19-0271-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.045