傅里葉變換衰減全反射紅外光譜技術對稻谷中常見有害霉菌的快速鑒別

劉凌平,和肖營,都立輝,沈 飛,袁 建,鞠興榮

(南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心/江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210046)

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傅里葉變換衰減全反射紅外光譜技術對稻谷中常見有害霉菌的快速鑒別

劉凌平,和肖營,都立輝*,沈 飛,袁 建,鞠興榮

(南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心/江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210046)

本研究利用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜技術(ATR-FTIR)結合化學計量學方法,對稻谷中7種常見有害霉菌(尖孢鐮刀菌Pr、尖孢鐮刀菌Po、尖孢鐮刀菌M23、黃灰青霉Pe、擴展青霉3.7898、灰綠曲霉3.3975和亮白曲霉)進行了快速鑒定。結果顯示,運用主成分分析法(PCA)能夠有效區分七種不同類別的菌株樣品。建立的線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型,對7種不同類別菌株的留一交互驗證整體正確率分別達到87.1%和87.3%。說明運用ATR-FTIR技術對稻谷侵染霉菌的種類實現快速鑒別具有一定可行性。

ATR-FTIR,稻谷,霉菌,快速鑒別

Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

糧食在高溫高濕條件下極易發霉變質,不僅造成經濟損失,且多數產毒霉菌的次級代謝產物嚴重威脅人畜健康[1]。目前,糧食中霉菌種類的檢測方法主要包括:平板菌落計數法[2]、高效液相色譜法[3-4,10]、氣相色譜與質譜聯用法[5-6]、PCR和免疫法[7-9]等,然而,上述方法存在操作繁瑣、靈敏性低,或成本高、耗時長等不足之處,難以實時監測霉菌的生長狀況。因此,急需發展一種能夠快速識別糧食中產毒霉菌的檢測方法。

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜(ATR-FTIR)法具有制樣簡單、無損和檢測靈敏度高等特點[11-12],是一種有效的微生物識別及鑒定手段[13]。Naumann等[14]研究表明,傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術可用于微生物的區分、歸類和識別。目前,基于FTIR技術用于微生物特性的研究備受研究者青睞。柴阿麗等[13]運用ATR-FTIR技術結合聚類分析法對來自14個屬的17株真菌進行鑒別,達到理想效果。Volha Shapaval等[15]運用FTIR法分析5種菌屬的11種真菌,結果表明,曲霉、毛霉、擬青霉可依據脂肪酸、脂質和碳水化合物的變化將其區分開來,且基于脂蛋白的差異可以區分交鏈孢霉和莖點霉。A.Lecellier等[16]通過由486種真菌的紅外光譜信息構成的數據庫進行匹配,達到快速鑒別霉菌的目的。然而,目前多數研究僅限于霉菌種類的區分,缺乏對糧食中霉菌的鑒別分析。

綜上,本研究將采用ATR-FTIR法對稻谷中七種常見有害霉菌進行檢測,結合主成分分析(PCA)、線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)建立7種霉菌的快速判別模型[17],為ATR-FTIR法實現谷物中霉菌的快速檢測及早期預警提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

七種稻谷中常見有害霉菌 灰綠曲霉3.3975、亮白曲霉、黃灰青霉菌Pe、擴展青霉3.7898、尖孢鐮刀菌Po、尖孢鐮刀菌Pr、尖孢鐮刀菌M23,七種霉菌均為稻谷中分出并經過基因鑒定;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA) 北京陸橋技術有限責任公司;甘油 北京索萊寶科技有限公司。

傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司;血球計數板 上海求精生化試劑儀器有限公司;EX30生物顯微鏡 寧波舜宇儀器有限公司;載玻片 鹽城市飛舟玻塑有限公司;單人雙面超凈工作臺 上海三發科學儀器有限公司;冰箱 青島海爾股份有限公司;WH-2微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;隔水式恒溫培養箱 南京曉曉儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 霉菌的培養 采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養。500 mL三角瓶裝入400 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基,經121 ℃滅菌20 min后,待培養基冷卻到55 ℃左右時,將培養基倒入到滅菌過的一次性的培養皿中,待培養皿中的培養基凝固后,將七種霉菌分別接種到培養基上,在培養箱中培養,培養溫度為28 ℃。

1.2.2 孢子懸浮液的收獲與處理 將培養5 d后的霉菌取出,取4 mL滅菌的甘油-水(%v/v,1∶10)溶液于培養基表面,輕微震蕩后,移取培養基表面的孢子懸浮液于EP管中,置于-20 ℃保藏備用。

1.2.3 霉菌孢子的計數 將孢子懸浮液置于微型旋渦混合儀上震蕩10 s,取50 μL孢子懸浮液于血球計數板上,在EX 30生物顯微鏡下觀察并計數,為驗證ATR-FTIR對霉菌光譜的特異性以及不同孢子懸浮液濃度的影響,分別對以上樣品稀釋10倍和20倍,共計得到62份樣品,進行檢測分析。

1.2.4 ATR-FTIR光譜采集 利用德國布魯克公司的FTIR儀,結合ATR附件(Pike公司,美國)采集不同濃度的7種霉菌孢子懸浮液的光譜信息。先掃描背景(空氣),然后,移取4 μL的樣品于ZnSe晶體上進行檢測,掃描32次,分辨率為4 cm-1,測量范圍4000～800 cm-1,每個樣品檢測3次,取平均光譜建模。不同樣品間需用無水乙醇擦拭平臺以避免交叉污染。

1.3 數據分析方法

采用SPSS 16.0軟件,TQ analyst 6.0和Matlab 7.0 軟件對樣品光譜數據進行分析。運用主成分分析法(PCA)對樣品聚類趨勢進行分析,線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA),并運用留一交互驗證法對模型性能進行驗證。

2 結果與討論

2.1 霉菌孢子計數結果

顯微鏡計數結果顯示,七種霉菌懸浮液樣品的濃度分別為:擴展青霉3.7898:5.5×106個/mL,黃灰青霉Pe:5.4×106個/mL,尖孢鐮刀菌Pr:1.9×107個/mL,尖孢鐮刀菌Po:1.425×107個/mL,尖孢鐮刀菌M23:6.9375×106個/mL,灰綠曲霉3.4.5×106個/mL,亮白曲霉:1.02×107個/mL,七種霉菌孢子懸浮液的孢子數均在一個數量級或在相近的數量級,即它們的孢子濃度相近。

2.2 ATR-FTIR光譜圖

圖1為7種霉菌孢子懸浮液在4000～800 cm-1的紅外光譜圖。由于7種霉菌孢子懸浮液的化學成分相似,導致樣品紅外光譜圖的整體趨勢及出峰位置一致,難以直觀判別不同樣品。對光譜圖分析可知,在3700～2996 cm-1處與O-H、N-H伸縮振動有關的吸收[18],1800～1450 cm-1處關于蛋白質酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶的吸收[19],1185～900 cm-1處為C-O-C和C-O-P的伸縮振動帶[20-21]。仔細觀察可知,不同霉菌樣品的光譜曲線在1000～900 cm-1區域存在明顯差異,表明其內部成分存在細微差異。鑒于不同霉菌樣品懸浮液的紅外光譜圖無明顯差異,下一步需對光譜信息進一步分析。

圖1 7種霉菌孢子懸浮液樣品的ATR-FTIR光譜圖Fig.1 ATR-FTIR spectra of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

2.3 PCA結果

圖2為7種不同濃度的霉菌孢子懸浮液光譜信息的主成分得分圖。由圖2可知,從菌屬來看,尖孢鐮刀菌屬、青霉屬和曲霉屬3種菌屬樣品有大致分離趨勢,說明三種菌屬樣品之間的差異較為明顯,曲霉類樣品可完全區分于其他2類。除了個別來自青霉菌屬的樣品與其他類別混在一起之外,大部分樣品能夠被很好的區分。進一步觀察7類霉菌樣品的聚類趨勢可知,除了3種尖孢鐮刀菌樣品及黃灰青霉Pe樣品間存在部分重疊之外,其余3種霉菌可區分良好。結果表明,不同霉菌樣品懸浮液的紅外光譜吸收強度存在區別,PCA可以提取不同樣品間的差異信息,采用ATR-FTIR法識別稻谷中的不同霉菌具有可行性。下一步將利用從光譜中提取的前10個主成分建立不同菌屬的判別分析模型。

表1 7種霉菌孢子懸浮液樣品的LDA模型留一交互驗證結果

Table 1 Discrimination results of cross-validation LDA of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

類別預測類別尖孢鐮刀菌Pr尖孢鐮刀菌Po尖孢鐮刀菌M23黃灰青霉Pe擴展青霉37898灰綠曲霉33975亮白曲霉正確率(%)尖孢鐮刀菌Pr100000001000尖孢鐮刀菌Po2800000800尖孢鐮刀菌M233060000667黃灰青霉Pe00090001000擴展青霉378980001500833灰綠曲霉339750000081889亮白曲霉0000018889總計871

表2 7類霉菌樣品的留一交互驗證PLS-DA模型判別結果

Table 2 Discrimination results of cross-validation PLS-DA of seven fungal species

項目尖孢鐮刀菌Pr尖孢鐮刀菌Po尖孢鐮刀菌M23黃灰青霉Pe擴展青霉37898灰綠曲霉33975亮白曲霉樣品量(個)101099699正確率(%)991894792888796955796敏感性(%)100827904887981982925特異性(%)981788885887925911925

圖2 7種霉菌孢子懸浮液樣品的PCA得分圖Fig.2 PCA scores plot of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

2.4 LDA結果

7種霉菌孢子紅外光譜信息的LDA函數得分圖如圖3所示。結果顯示,不同類別霉菌樣品在水平方向的位置相距較遠,差異明顯,除青霉菌屬間和曲霉菌屬間出現部分重疊外,其余樣品均能被完全區分,其結果優于PCA。留一交互驗證結果如表1所示,整體判別正確率為87.1%,其中僅尖孢鐮刀菌M23的判別正確率偏低,3個樣誤判為尖孢鐮刀菌Pr,其余結果均大于或等于80%。尖孢鐮刀菌Pr和黃灰青霉Pe的判別正確率最高,均為100%。另外,仔細觀察發現,誤判均發生在不同菌屬內,3類菌屬間的判別正確率同為100%。

圖3 7種霉菌孢子懸浮液樣品紅外光譜信息的LDA得分圖Fig.3 LDA score map of the infrared spectra of spore suspensions from seven kinds of fungal strains

2.5 PLS-DA結果

為比較不同化學計量學方法對模型精度的影響,進一步運用主成分得分建立PLS-DA判別分析模型[22],結果如表2所示。結果顯示,模型對尖孢鐮刀菌Pr和灰綠曲霉3.3975類樣品的判別精度最佳,對尖孢鐮刀菌M23、擴展青霉3.7898和亮白曲霉的精度稍差。7類樣品的判別正確率為79.2%～99.1%之間,整體平均判別正確率為87.3%,與LDA方法所得整體判別正確率值類似。表明ATR-FTIR技術,結合化學計量學方法,在霉菌菌屬鑒別上取得了良好的效果。進一步的研究,應該擴大樣本量,運用多種特征提取方法,以進一步提高模型的精度、適用性和穩健性。

3 結論

本文利用ATR-FTIR技術對稻谷中7種常見有害霉菌進行了快速檢測分析。PCA結果顯示不同類別的霉菌樣品可被良好區分,且樣品孢子懸浮液濃度對結果影響不明顯,建立的LDA和PLS-DA模型對7種霉菌的留一交互驗證結果的整體判別正確率分別為87.1%和87.3%,且尖孢鐮刀菌屬、青霉菌屬和曲霉菌屬間的判別正確率高達100%。結果表明,ATR-FTIR技術可用于谷物中霉菌不同屬間的快速鑒別,尤其對不同菌屬的霉菌具有良好的判別效果。

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Application of attenuated total reflection-fourier transform infrared spectroscopy for rapid identification of fungi strains on grain

LIU Ling-ping,HE Xiao-ying,DU Li-hui*,SHEN Fei,YUAN Jian,JU Xing-rong

(College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing,

Attenuatedtotalreflection-Fouriertransforminfraredspectroscopy(ATR-FTIR)wasusedincombinationwithchemomoetricsinthisstudyforrapididentificationofsevenstrainsoffungithatusuallycauseseriouslyeconomicdamagetopaddyrice(Fusarium oxysporumPr,Fusarium oxysporumPo,Fusarium oxysporumM23,Penicillium aurantiogriseumPe,Penicillim expansum 3.7898,Aspergillus glaucus 3.3975andAspergillus candidus).Theresultsindicatedthat,principalcomponentanalysis(PCA)couldeffectivelydistinguishthesevenfungistrains.Theoverallcorrectclassificationinleaves-one-outcross-validationfordifferentkindsofstrainsobtainedbylineardiscriminantanalysis(LDA)andpartialleast-squaresdiscriminantanalysis(PLS-DA)modelwas87.1%and87.3%,respectively.TheresultsverifiedthattheuseofATR-FTIRtechnologymightbefeasibleforrapididentificationofthespeciesoffungicontaminationonpaddyrice.

ATR-FTIR;grain;fungi;strains;rapididentification

2016-03-21

劉凌平(1989-),女,碩士研究生,研究方向:糧食儲藏過程中的霉菌預警及其控制，E-mail:1091624063@qq.com。

*通訊作者:都立輝(1981-),男,博士生,副教授,研究方向:糧食儲藏過程中的霉菌預警及其控制，E-mail:ddabc_2000@163.com。

糧食公益性行業科研專項經費資助(201313002-01)以及江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)19-0298-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.049