優質綿羊冷凍胚胎引進及胚胎移植試驗*

張新軍，劉長彬*，倪建宏，萬鵬程

（1.新疆生產建設兵團第七師一二七團畜牧服務中心，新疆奎屯833200；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室）

優質綿羊冷凍胚胎引進及胚胎移植試驗*

張新軍1，劉長彬2*，倪建宏2，萬鵬程2

（1.新疆生產建設兵團第七師一二七團畜牧服務中心，新疆奎屯833200；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室）

2014—2015年先后從澳大利亞西奧谷河育種公司引進薩福克和肉用美利奴肉羊冷凍胚胎773枚。解凍后可用于移植的胚胎為739枚，移植受體羊739只。其中，A級胚胎553枚，B級胚胎186枚，且A級胚胎移植受胎率為50.27%（278/553），明顯高于B級胚胎的39.25%（73/186），差異顯著。同時，對比了大尾羊和細毛羊2種受體羊品種間的受胎率，結果為差異不顯著。不同飼養條件下胚胎移植受胎率結果顯示，全舍飼羊受胎率為39.56%（178/450），放牧羊受胎率為49.48%（143/289），兩者差異顯著。大規模進口肉羊冷凍胚胎進行移植在基層生產單位的成功應用，為肉羊產業發展提供了優良的種質資源。

綿羊；冷凍胚胎；胚胎移植

動物胚胎工程技術是家畜繁殖學領域的一項高新技術，既將良種母畜受孕后的早期胚胎通過人工方法取出，再將其移植到同種、同生理時期的母畜體內，并繼續發育成新個體。胚胎移植亦稱為受精卵移植，或稱為“借腹懷胎”[1-2]。哺乳動物胚胎移植技術的發展已有100多年的歷史。1890年，英國劍橋大學的Walter Heape在安哥拉兔上首次成功獲得胚胎移植后代。美國的Warwick等在1934年成功進行了綿羊胚胎移植，該技術已發展了78年[3]。以引進動物冷凍胚胎的形式進行胚胎移植，不但節省人力、物力、財力，還可一次大量引進，而且可以把引種過程中疾病傳播的幾率降到最低限度[4]。馬保華研究報道，供體與受體之間同期發情同步差在±1 d或0～24 h，胚胎移植受胎率較高，能夠獲得較為理想的胚胎移植效果[5-10]。

目前，中國許多省市、自治區等都已嘗試進行大規模羊胚胎移植工程，并取得了一定的成績。據統計，羊鮮胚胎移植妊娠率達54.4%～60.0%，最高達70.8%[11]。現將在2014—2015年進行的綿羊規模化冷凍胚胎移植試驗進行總結。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1胚胎品種及來源

品種為薩福克和肉用美利奴羊，購自澳大利亞西奧谷河育種公司。

1.1.2供試動物

受體羊為2～5歲生殖系統健康、無傳染病的本地大尾羊和新疆細毛羊。

1.1.3供試器材

擁有自主知識產權的羊專用手術架，腹腔內窺鏡（OLYMPUS），實體顯微鏡（NIKON），Holding液、蔗糖液、冷凍液（ICP），CO2鋼瓶（國產），恒溫水浴鍋，止血鉗、手術刀、剪刀、持針鉗、縫合針及線、創巾、工作服、注射器（1 mL、5 mL和20 mL）、先穴式胚胎移植管、一次性培養皿、溫度計、布膠帶、曲別針、碘酒及酒精、消毒液、抽紙等主要實驗器材及耗材。

1.1.4供試藥品

同期發情陰道海綿栓、孕馬血清促性腺激素（PMSG，1 000 IU·瓶）、黃體酮、油劑青霉素、速眠新及蘇醒靈（長春農牧大學軍事獸醫研究所）。

1.2方法

1.2.1胚胎鑒定

在體視鏡下對解凍的胚胎進行分級鑒定，根據胚胎形態的完整性及內細胞團的致密程度分為A、B、C級。胚胎鑒定標準：（1）胚胎細胞團呈均勻對稱的球形，形態典型，單個分裂球的大小、顏色、密度一致，輪廓清晰，胚胎發育階段與預期的發育階段一致者為A級；（2）胚胎細胞團的大小和形狀以及單個細胞的顏色和密度存在一定的不規則，細胞質較致密，分布均勻，具有完好的、具活性的胚胎細胞團者為B級；（3）胚胎細胞團的大小和形狀以及單個細胞有明顯變異，分裂球輪廓稍不清晰，或部分不清晰，細胞質不致密，分布不均勻，色調發暗，但仍有部分細胞結構是完好的、有活性的胚胎細胞團者為C級。

1.2.2胚胎移植

采用微創手術，用移胚針將符合質量要求的胚胎移植到與胚胎胚齡同期化的受體羊子宮角內，移植后立即頸部肌肉深部注射黃體酮1 mL。

1.2.3妊娠檢查

于胚胎移植后45～60 d進行B超檢查，統計受胎率。

1.2.4試驗資料的統計與分析

試驗數據采用卡方檢驗進行差異顯著性分析。

2　結果

2.1不同胚胎級別對受體受胎率的影響

在本試驗中，共解凍了引進冷凍胚胎773枚，達到移植級別的胚胎739枚，C和D級胚胎34枚，占可移植胚胎的4.6%（34/739）；將可移植胚胎用于移植后，A級胚胎受胎率為50.27%（278/553），B級胚胎為39.25%（73/186），兩者之間差異顯著（P＜0.05），見表1。

表1　冷凍胚胎解凍后胚胎級別分布及移植受胎率情況

2.2不同品種受體羊的受胎率分析

本試驗共處理了274只羊，大尾羊發情率為91.36%（148/162），細毛羊發情率96.43%（108/112）；大尾羊移植受胎率36.49%（54/148），細毛羊移植受胎率42.59%（46/108）。從表2可以看出，在相同的同期發情處理方式下，在同期發情效率上差異不顯著（P＞0.05），2個品種間的受胎率同樣差異不顯著（P＞0.05），見表2。

2.3不同飼養方式對受體受胎率的影響

表2　不同綿羊品種對受胎率的影響

本試驗共移植了受體739只，其中全舍飼羊450只，放牧羊289只。全舍飼羊受胎率為39.56%（178/450），放牧羊受胎率為49.48%（143/289），放牧飼養管理條件下的受體羊獲得更高的受胎率，差異顯著（P＜0.05），見表3。

表3　不同飼喂方式對綿羊受體受胎率的影響

3　結論

胚胎的冷凍對胚胎是一種傷害，因此，在冷凍前必須選擇A級胚胎進行冷凍，以確保解凍后的胚胎能夠維持A級或B級的分級級別，才能有效保障受體羊獲得更高的移植受胎率。從表1可以看出，A級胚胎經冷凍解凍后獲得了50.27%（278/553）的受胎率，而B級胚胎冷凍解凍后獲得了39.25%（73/186），兩者之間差異顯著（P＜0.05）。冷凍試驗的C和D級冷凍胚胎解凍后，內細胞團散、透明帶破裂和解凍后找不到明顯的胚胎等情形，而無法進行胚胎移植，因此，C和D級胚胎不用于冷凍，如果有條件可以直接鮮胚移植。

受體羊同期發情效率的高低是影響胚胎移植效率的關鍵因素之一，一般情況下，同期發情效率受季節、營養、處理方案、藥物等的影響。本試驗中對2種受體羊品種進行了同期發情處理，采取每天觀察2次，每次觀察發情時間30 min至1 h，且看到受體羊表現為爬跨靜立、外陰出現紅腫、流透明粘液和精神不安等即判斷為發情[12]。從表2可以看出，大尾羊與小尾羊的發情效率相當，差異不顯著。經過胚胎移植后，兩組的受胎率差異同樣不顯著。

從表3可以看出，放牧綿羊的受胎率高于全舍飼，主要是因為放牧羊能夠充分運動，再者是放牧羊能夠采食到優質的新鮮牧草、牧草果實或優質干草。由于放牧羊能夠獲得更為全面的維生素、微量元素和蛋白的營養供應，因此，放牧羊的移植受胎率明顯高于全舍飼羊的受胎率，差異顯著（P＜0.05）。

綜上所述，綿羊胚胎移植是一個系統工程，其受體選擇、激素、時間、季節和管理與營養等一系列環節緊密相扣，任何一個環節出現問題都將導致胚胎移植失敗。只有做到精心挑選受體、嚴格操作、無菌措施以及精準移植等，胚胎移植工作才能收到滿意效果。

[1]傅文棟，李風德，牛建克.綿羊胚胎移植研究進展[J].黑龍江動物繁殖，2010，（18）5：20-21.

[2]侯引緒.綿羊胚胎移植產業化技術研究[D].北京：中國農業大學，2006.

[3]肖西山，程鵬，李玉冰，等.胚胎移植在家畜生產中的應用[J].北京農業職業學院學報，2004，60（18）：26-28.

[4]李銘，黃恒，張立，等.綿羊規模化胚胎移植試驗效果與分析[J].中國農學通報，2010，26（17）：17-19.

[5]馬保華，張紅，李鍵，等.山羊胚胎移植受體同期發情優化程序研究[J].西南農業學報，2004，17（5）：664-667.

[6]Armstrong D T，Pfitzner A P，Warnes G M，et al.Superovulation treatments and embryo transfer in Angora Goats[J].J Reprod Fert，1983，67（2）：403-410.

[7]李鍵，馬保華，張紅，等.胚胎移植不同品種受體羊同期發情研究[J].西南農業學報，2005，18（3）：343-347.

[8]馬保華，王光亞，趙曉娥.胚胎移植供受體山羊發情控制及配比問題的研究[J].動物醫學進展，1999，20（3）：35-38.

[9]劉長彬，楊永林，張賓，等.阿勒泰大尾羊受體羊同期發情處理程序優化效果[J].甘肅畜牧獸醫，2013，43（1）：36-37.

[10]陳卓，谷紅偉，方治中，等.肉羊二細胞期胚胎（二分胚）移植試驗研究[J].甘肅畜牧獸醫，2016，46（11）：83-85.

[11]王玉琴，趙有璋.綿羊胚胎移植關鍵技術[J].中國草食動物，2004（S1）：82-84.

[12]董紅，舒展，陳靜波，等.影響農牧區綿羊胚胎移植效果因素分析[J].草食家畜，2011，6（2）：27-30.

2016—09—23

國家級肉羊“胚胎移植基地”和兵團級肉羊“胚胎生產”基地；兵團院士基金專項（2013BB023）；兵團重大科技項目（2013AA003-2）。

劉長彬（1977-），男，河南虞城人，副研究員，研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail：xlchangbin@163.com。