雜色鮑AP-1的克隆及在發育和弧菌感染后的表達分析

王國棟，和四梅，張麗莉，王藝磊

( 集美大學 水產學院，農業部東海海水健康養殖重點實驗室，福建 廈門361021；集美大學 水產生物技術研究所，福建 廈門 361021 )

雜色鮑AP-1的克隆及在發育和弧菌感染后的表達分析

王國棟，和四梅，張麗莉，王藝磊

( 集美大學 水產學院，農業部東海海水健康養殖重點實驗室，福建 廈門361021；集美大學 水產生物技術研究所，福建 廈門 361021 )

激活蛋白1(AP-1)是具有亮氨酸拉鏈功能域的轉錄因子，參與了發育和免疫等多個生物學過程。為研究該基因在雜色鮑發育和免疫中的作用，本研究克隆了雜色鮑AP-1基因的全長cDNA(命名為HdAP-1)，并分析了HdAP-1在各組織、各發育時期以及副溶血弧菌刺激后的表達特征。結果表明，HdAP-1 cDNA 全長為 1482 bp，5′非編碼區域(5′UTR)為133 bp，3′UTR為 401 bp，開放閱讀框為948 bp。該基因編碼蛋白預測分子量為 34.83 ku，等電點為9.43，具有典型AP-1蛋白家族的Jun轉錄因子功能域和bZIP功能域。HdAP-1在所檢測7個組織中均有表達，其中血淋巴表達量最高，鰓、腎、腸和黏液腺的表達量次之，肝胰腺和外套膜表達量最低。自受精卵至囊胚期HdAP-1的表達量顯著低于原腸胚 (P<0.05)，由原腸胚到擔輪幼蟲該基因表達量繼續上升，擔輪幼蟲至匍匐幼蟲期均維持較高的表達水平，變態后在稚鮑中的表達量下降。在副溶血弧菌感染24 h后，HdAP-1表達量顯著上升(P<0.05)。其他時段該基因的表達量與對照組相比差異不顯著 (P>0.05)。

雜色鮑；激活蛋白(AP-1)；基因表達；發育；細菌感染

激活蛋白1(AP-1)蛋白家族是一類亮氨酸拉鏈轉錄因子，能夠調節細胞增殖、遷移、存活、生長、分化和凋亡等細胞過程[1-2]。在哺乳動物細胞中，AP-1能夠形成同聚二聚體或與同家族的jun、fos和atf等形成異聚二聚體，并可以與特異DNA基序[TGA/C(G)TCA]結合[2]。通過與DNA基序結合，AP-1復合體能夠控制細胞因子在不同類型組織和細胞中的表達[3-5]，在調節炎癥方面具有重要作用[3]。作為先天免疫反應的重要分子，AP-1的激活受TLR、TNF和RIG等多個信號傳導通路的調控[6-7]，同時還需要干擾素和白介素等多種細胞因子參與[8-9]。由于AP-1能夠和很多分子發生相互作用，參與了多個生物學過程，所以在哺乳動物中研究較為透徹。已有諸多報道表明，AP-1蛋白家族的重要成員Jun轉錄因子參與了哺乳動物的免疫防御[10-11]。鑒于AP-1能夠調控大量免疫相關基因的表達，開展無脊椎動物AP-1基因的研究可以對其先天免疫應答作用機制的探討提供一定參考[12]。

海洋無脊椎動物AP-1的研究相對較少，在皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)[13]、香港巨牡蠣(Crasstreahongkongensis)[14]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[15]和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[12]中有報道表明，其參與了免疫過程。雜色鮑(H.diversicolor)自然分布于我國東南沿海地帶，是我國主要的養殖貝類之一。近年來因種質退化以及養殖規模工廠化和集約化程度的不斷提高等原因導致雜色鮑爆發性病害頻發[17]，成為阻礙我國雜色鮑的養殖發展的主要因素。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是雜色鮑的主要病原菌之一，常導致雜色鮑的大量死亡[18-19]。因此，筆者進行了雜色鮑AP-1基因的克隆和在副溶血弧菌感染后的表達分析研究。希望研究結果為了解雜色鮑的免疫機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

殼長4.5～5.0 cm雜色鮑購自廈門大嶝島養殖場，試驗前暫養于新鮮海水中，投喂新鮮的江蘺和海帶。每兩天換水一次，保持海水溶氧量>5 mg/L，水溫控制在其最適生長溫度23～25 ℃。飼養兩周后，用于雜色鮑的育苗、成體取樣以及細菌感染試驗。

1.2 雜色鮑各組織以及發育各時期樣品采集

取10只健康雜色鮑，解剖后分別采集肝胰腺、血淋巴細胞、上足、鰓、腎、黏液腺、腸和外套膜。所取的組織液氮速凍后，存于-80 ℃備用。用手術刀在鮑腹足中央切開約1 cm缺口，用膠頭滴管吸取血液于離心管中，4 ℃，2000 r/min離心10 min，棄上清液后，獲得血淋巴細胞。

選取體質健壯，足肌活動敏捷，性腺外觀飽滿，雌雄各30只為親鮑。采用綜合誘導法分別對雌雄親鮑刺激。親鮑分雌雄兩組，經0.5～1 h的陰干刺激后，用紫外線照射海水(200～300 mW·h/L)，處理2～4 h，然后經 ±3 ℃的變溫刺激，即可獲得精子和卵子。隨后進行人工授精，精卵分別收集到一塑料容器中。受精時，卵子密度20～100 個/mL，精子密度5×105個/mL，不斷輕輕攪動水體，加速精卵結合，受精后及時洗精卵3～4次，每次間隔約30 min。將受精卵轉至水溫(25 ± 1) ℃、鹽度32 ± 1 的新鮮海水中繼續培養，用普通光學顯微鏡觀察卵裂狀況。收集受精卵、2細胞期、4細胞期、桑葚胚、囊胚期、原腸期、擔輪幼蟲、面盤期幼蟲、匍匐幼蟲和變態后稚鮑，將采集樣品液氮速凍后，存于-80 ℃待用。

1.3 副溶血弧菌細菌感染試驗

參照文獻[19-20]的方法進行。雜色鮑經2 周馴養后，在腹足肌肉注射 50 μL 密度為 1.1×108cfu/mL的副溶血弧菌菌液，對照組注射 50 μL 滅菌新鮮海水。在注射后的0、3、6、12、24、48 h，分別取試驗組和對照各10只雜色鮑的血淋巴和鰓放入液氮速凍，存于-80 ℃待用。

1.4 總RNA提取和cDNA的合成

樣品由-80 ℃轉至Trizol溶液 (Roche公司) 中，按照說明書提取樣品總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，微量紫外分光光度計測定濃度和純度。

取1.5 μg總RNA與分別與1 μL oligo (dT) (10 μmol/L) 或1 μL 3′CDS primer (10 μmol/L)或1 μL 5′CDS primer (10 μmol/L) 混合，按照SMART PCR Synthesis Kit (Clontech 公司) 的說明合成cDNA。逆轉錄所用引物見表1。

1.5 HdAP-1基因的克隆及序列分析

根據雜色鮑轉錄組篩選得到的HdAP-1片段，用Primer 3(http://primer3.ut.ee/)設計的RACE引物擴增其全長cDNA，并進行3′RACE和5′RACE，用head to toe PCR驗證其開發閱讀框的正確性。PCR產物瓊脂糖電泳后，割膠純化，送至生工生物工程(上海)股份有限公司，用Sanger法雙端測序。所用引物見表1。

采用美國國立生物技術信息中心NCBI的Vecscreen去掉測序載體序列，用bl2seq拼接序列，經blastx和ORF Finder確定其開放閱讀框后，用歐洲分子生物學開放軟件包(http://imed.med.ucm.es/EMBOSS/) 的prettyseq程序進行核酸序列和蛋白序列翻譯。使用ExPASy (http://www.expasy.org/)預測其編碼蛋白等電點及分子量，使用NetPhos 2.0 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測磷酸化位點，使用NetNGlyc 1.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 預測糖基化位點，TMHMM2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測蛋白跨膜結構域，利用BioEdit軟件進行序列的多重比對，利用MEGA 4.0軟件中鄰位相接法構建系統進化樹。

表1 所用引物及其序列

1.6 實時定量PCR

利用表1的定量引物，以oligo (dT)逆轉錄合成cDNA為模板，按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO公司)的說明進行實時定量PCR。依據雜色鮑內參基因穩定性的研究結果[18,21]，發育階段以YB1為內參基因，其他以β-actin為內參基因。檢測擴增產物溶解曲線和擴增曲線，并測序，以驗證擴增特異性。每個時相分析10個樣品，計算每個樣品的2-ΔΔCt為RQ值，基因的表達水平表示為RQ平均值±標準差。組織表達和發育階段用ANOVA進行數據方差分析，Duncan多重比較分析各組織和各階段表達的差異性，弧菌感染進行t檢驗分析，顯著性差異表示為P<0.05。

2 結 果

2.1 HdAP-1全長cDNA克隆

HdAP-1 cDNA 全長為 1482 bp，包括 133 bp 的 5′非編碼區域，401 bp 3′非編碼區域和 948 bp 開放閱讀框，該開放閱讀框編碼 315 個氨基酸(圖1)。推導蛋白的預測分子量為 34.83 ku，等電點為 9.43。包含Jun轉錄因子功能域(Jun transcription factor domain, 38～226 aa )和 bZIP功能域(basic leucine zipper domain, 235～299 aa )，2個糖基化位點，19 個磷酸化位點。Blastp比對結果顯示，本試驗所得序列與盤鮑AP-1(ADQ43242.1)、太平洋牡蠣AP-1(C.gigas, EKC41210.1)、 菲律賓蛤仔AP-1(ADZ48236.1)和斑馬魚(Daniorerio, NP_956881.1)的一致性分別達到97%、63%、56%和45%。

圖1 HdAP-1基因cDNA及推導的氨基酸序列終止密碼子(taa)和加尾信號(AATAAA)用粗體表示，方框表示磷酸化位點，圓圈表示糖基化位點，下劃線部分 Jun轉錄因子功能域(38～226 aa)，虛線線部分為跨膜區域 (235～299 aa).

2.2 同源分析和系統發育分析

將HdAP-1推導的氨基酸序列與其他物種的 AP-1蛋白進行多重序列比對(圖2)，結果顯示有一個相對保守bZIP結構域。其中亮氨酸拉鏈基序以每隔7個氨基酸殘基出現一個亮氨酸為特征，并且亮氨酸前后一般會有堿性氨基酸殘基(R)。

圖2 雜色鮑和其他物種的AP-1氨基酸序列比較分析方框為bZIP功能域，箭頭部分為亮氨酸拉鏈基序的亮氨酸殘基.雜色鮑、香港巨牡蠣、斑馬魚、原雞(Gallus gallus)和人等5個物種的AP-1蛋白的登錄號分別為AGE82886.1、AHF51977.1、NP_956281.1、NP_001026460.1和NP_002219.1.

采用 MEGA 4.0 軟件，以鄰位相連法構建系統進化樹。HdAP-1首先與盤鮑的AP-1聚為一支，然后與雙殼類聚為貝類一組。同時，脊椎動物也聚為一組，然后與海膽聚在一起，最后與貝類聚在一起(圖3)。

圖3 AP-1氨基酸序列的NJ系統進化樹

2.3 組織、發育和弧菌感染的表達分析

HdAP-1在檢測7個組織中均有表達，以血淋巴中表達量最高，顯著高于其他組織(P<0.05)，鰓、腎、腸和黏液腺的表達量次之，而肝胰腺和外套膜表達最低，顯著低于其他組織(P<0.05) (圖4)。

自受精至囊胚期，HdAP-1表達量一直維持非常低的表達水平，顯著低于其他發育階段(P<0.05)。自原腸胚期開始的表達量顯著上升，發育到幼蟲階段時HdAP-1表達量最高，顯著高于其他階段(P<0.05)。變態成為稚鮑后表達量顯著下降(P<0.05) (圖5)。

在副溶血弧菌感染24 h后，HdAP-1表達量顯著上升(P<0.05)。其他取樣時相，該基因的表達量在弧菌感染組與對照組間差異不顯著(P>0.05) (圖6)。

圖4 HdAP-1基因各組織相對表達量Hp:肝胰腺，Gi:鰓，Mn：外套膜，Ki：腎，Dt：消化道，Mg：黏液腺，Hm:血淋巴.相同字母表示差異不顯著(P>0.05), 不相同字母差異顯著(P<0.05).

3 討 論

AP-1作為轉錄因子參與眾多生物學過程，其結構具有AP-1蛋白家族的典型特征，即N端具有Jun功能域，C端具有bZIP功能域。bZIP功能域高度保守，可以形成二聚體，并且能夠和DNA大溝結合[22]。比對結果表明，HdAP-1的bZIP功能域與人、斑馬魚具有高度的保守性。HdAP-1具有多個磷酸化位點，這表明其活性受到翻譯后磷酸化修飾調控。酪蛋白激酶Ⅱ、糖原合成酶激酶3β和核糖體S6激酶2等能夠通過磷酸化調節AP-1的活性[1]。人AP-1的S63/S73/T91/T93/T231/T243等6個與活性相關的磷酸化位點在雜色鮑中也高度保守。本試驗所得HdAP-1中，這些保守的氨基酸殘基也可以通過磷酸化來調節HdAP-1的活性。

圖5 HdAP-1基因在各發育階段的表達量FE：受精卵，2C：2細胞期，4C：4細胞期，MO：桑葚胚期，BL：囊胚期，GA：原腸胚期，TR：擔輪幼蟲， VE：面盤幼蟲，CR：匍匐幼蟲，JU：稚鮑.相同字母表示沒有顯著差異(P>0.05), 不相同字母表示有顯著差異(P<0.05).

圖6 HdAP-1基因在副溶血弧菌感染后表達變化*表示對照組和弧菌感染組存在顯著性差異(P<0.05).

HdAP-1基因在雜色鮑所檢測組織中具有表達，這與盤鮑、凡納濱對蝦和菲律賓蛤仔的AP-1相同[12-13,15]，與AP-1基因家族成員在各組織中呈組成型表達類似[1]。AP-1的表達模式具有細胞或組織類型特異性，在不同的細胞或組織調節轉錄各自特異的基因，因而能夠發揮不同的作用[22-24]。HdAP-1在血淋巴中表達量最高，這與凡納濱對蝦和菲律賓蛤仔相同[12-15]。鑒于雜色鮑血淋巴在免疫反應中具有重要作用[25]，HdAP-1在血淋巴的高表達可能表明其在免疫過程中具有一定作用。在鰓、黏液腺、消化道等與外界刺激物直接接觸的組織同樣也具有較高的表達水平，表明其除了參與免疫過程外，可能在細胞凋亡等過程也具有重要作用[26]。這與同樣與凡納濱對蝦和菲律賓蛤仔類似[12-15]。但是HdAP-1在各組織的表達水平與盤鮑差別很大，在血淋巴、外套膜等組織表達水平甚至完全相反[13]。這可能是因采用不同內參所致。盤鮑的組織表達的內參基因采用的是核糖體蛋白L17(EF103427)，凡納濱對蝦、菲律賓蛤仔和雜色鮑均以β-actin為內參基因。

在鼠中大量的功能獲得或缺失試驗證明了AP-1參與了發育過程的調控[1]。本試驗中在原腸胚時期HdAP-1的表達水平顯著上升，在擔輪幼蟲至匍匐幼蟲階段一直處于較高的表達水平。在原腸胚階段，細胞開始大量的分化和遷移。AP-1作為轉錄因子參與了細胞分化、遷移和轉化[1]。因此在原腸胚時期，HdAP-1的表達量顯著上升。雜色鮑的幼蟲需經歷擔輪幼蟲、面盤幼蟲和匍匐幼蟲3個階段。不同階段的幼蟲形態結構差別巨大，細胞需要大量增殖、分化和遷移。之后需要經歷變態，成為在生態習性和機體結構同成體類似的稚鮑。變態過程中需要經歷細胞分化和組織重構，是細胞凋亡比較旺盛的階段[27-28]。因此在整個幼蟲時期，參與調節細胞增殖、分化、遷移和凋亡的HdAP-1維持在一個表達較高的水平。此外，鮑幼蟲變態一般需要外界環境因子的刺激來激活[27]。果蠅中的證據表明AP-1可以作為一個通用開關選擇性表達遺傳信息來響應外界環境的變化[28]。這是變態前的匍匐幼蟲HdAP-1高表達的原因之一。

AP-1能夠響應各種生理、病理和環境刺激，包括細胞因子、生長因子、神經遞質、多肽激素、紫外線輻射、細菌和病毒感染[29-32]。盤鮑、菲律賓蛤仔和凡納濱對蝦等無脊椎動物在病原刺激后AP-1表達量都有顯著性變化[12-13,15]。HdAP-1在弧菌處理后表達量顯著上升，與上述3種無脊椎動物的AP-1表達類似。表明在無脊椎動物AP-1能夠響應病原的刺激。在弧菌感染前24 h，HdAP-1的表達水平在對照組和弧菌注射組間幾乎相同，表明該基因在副溶血弧菌侵染前并未發揮防御作用。在24 h，弧菌注射組HdAP-1的表達量才顯著高于對照組，表明該基因參與了防御弧菌過程。AP-1的活性主要受MAPK信號通路調控[1]，在免疫信號傳導中屬于下游效應基因。在免疫應答的起始階段，主要是模式識別蛋白和信號通路上游因子參與病原的識別和信號的傳導[20]。例如，雜色鮑Toll樣信號通路的上游接頭分子IRAK4，在弧菌感染3 h表達量就顯著上升。而AP-1作為下游效應基因，直接激活其他免疫防御基因，參與病原的清除過程，因此在病原進入機體一段時間后才大量表達。

本試驗克隆了HdAP-1的全長cDNA，其編碼蛋白含有Jun和bZIP功能域，具備AP-1蛋白家族典型特征。該基因在各組織均有表達，以血淋巴含量最高，并在弧菌感染24 h時表達量顯著上升，這表明該基因參與了免疫防御。在發育過程，HdAP-1在擔輪幼蟲至匍匐幼蟲階段表達量最高，這表明其在幼蟲細胞增殖、分化、遷移和凋亡中具有重要作用。希望這些研究結果為雜色鮑的發育和免疫研究提供有益幫助。

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MolecularCloningandExpressionofActivatorProtein-1inSmallAbaloneHaliotisdiversicolorduringDevelopmentandBacterialChallenge

WANG Guodong, HE Simei, ZHANG Lili, WANG Yilei

( Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture, Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China; Institute of Aquaculture Biotechnology, Jimei University, Xiamen 361021, China )

Activator protein-1 (AP-1) is a transcription factor, which is characterized by highly conserved dimeric leucine zipper DNA-binding domain, and participates in development and immune processes. In order to evaluate the effect of AP-1 gene in development and immune response, the full cDNA of AP-1 gene (HdAP-1) was cloned in small abaloneHaliotisdiversicolorand challenged byVibrioparahaemolyticusand expressed during development of the abalone by real time PCR. The full cDNA of HdAP-1 was 1482 bp, and 5′/3′untranslated region had 133/401 bp, with a 948 bp open reading frame. The calculated molecular mass of encoded protein was 34.83 ku and the predicted pI 9.43. HdAP-1 contained Jun and bZIP domains, a highly conserved domains of AP-1 protein family. HdAP-1 was detected in all examined tissues. There was the maxmal expression level in hemolymph, middle expression level in gill/kidney/digestive tract/mucus gland, the minimal level in hepatopancreas/mantle. There was a low expression level from fertilized eggs to blastula stage, significantly lower than in gastrula stage (P<0.05). The expression of HdAP-1 continuously increased from gastrula stage to trochophore stage, with a high level from trochophore to creeping larva stage, and low level after metamorphosis. There was significant up-regulation of HdAP-1 24 h afterV.parahaemolyticuschallenge (P<0.05), without significant difference between control and bacterial challenge in other phase (P>0.05).

Haliotisdiversicolor; activator protein-1(AP-1); gene expression; development; bacterial infection

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.006

S917

A

1003-1111(2016)03-0227-07

2015-07-24；

2015-09-15.

國家自然科學基金資助項目(41006105，41176152)；福建省自然科學基金資助項目(2015J01142)；福建省高校杰出青年科研人才項目(JA12183).

王國棟(1977-)，男，副教授；研究方向：水生動物遺傳育種.E-mail：gdwang@jmu.edu.cn.通訊作者：王藝磊(1963-)女，教授；研究方向：水產經濟動物功能基因組學，蛋白質組學，水產生物技術.E-mail：ylwang@jmu.edu.cn.