七里海中華絨螯蟹遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析

石洪玥，劉 陽，王曉梅，高金偉，邱琳珊，李晶晶

( 1.天津農學院 水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津300384；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津300402 )

七里海中華絨螯蟹遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析

石洪玥1，劉 陽1，王曉梅1，高金偉1，邱琳珊1，李晶晶2

( 1.天津農學院 水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津300384；2.天津市水生動物疫病預防控制中心，天津300402 )

利用RAPD-PCR及ISSR-PCR兩種分子標記技術，分析了七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體的遺傳多樣性。用10個多態性高的RAPD引物對24個七里海中華絨螯蟹樣本個體進行擴增，共檢測出107個不同的擴增位點，擴增片段大小為300～2300 bp。其中多態位點總數為66個，平均多態位點比例為61.32%，群體內香農-維納多樣性值為0.1714。用 8 個多態性高的ISSR 引物對24個個體共檢測到106個位點，擴增片段為200～1500 bp。其中多態性位點79 個，平均多態位點百分率為74.53%，群體內香農-維納多樣性值為0.1778。結果顯示，該群體的多態位點比例和香農-維納多樣性值均較大，說明其有較豐富的遺傳多樣性，同時也說明RAPD和ISSR技術用于七里海中華絨螯蟹核基因組的遺傳多樣性分析，具有較高的檢出率和靈敏度。

七里海中華絨螯蟹；遺傳多樣性；RAPD-PCR；ISSR-PCR

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)在我國境內分布較廣，自然分布主要在長江水域、遼河水域、甌江水域及海河水域的四大水系中[1]。由于其極具市場價值，已成為我國水產養殖領域的重點培育品種。自20世紀70年代末中華絨螯蟹人工養殖和人工育苗的難關被突破后，中華絨螯蟹養殖改變了蟹苗完全依賴天然產量的局面，但隨著中華絨螯蟹養殖產業的迅猛發展[2-5]，天然中華絨螯蟹的苗種明顯不能滿足其需求，在養殖生產過程中需從各地引進苗種，導致中華絨螯蟹基因間的混雜以及優勢基因的喪失[6-7]。由于過度捕撈、環境污染、興修水利、水質資源變化等多種原因，蟹苗的自然資源產量已瀕臨枯竭。因此，通過有效的試驗技術對七里海中華絨螯蟹種質資源進行探究，分析其遺傳背景、遺傳差異和遺傳多樣性，不僅有助于七里海中華絨螯蟹種群的鑒別，而且對七里海中華絨螯蟹的養殖和育種也大有幫助[8]。

物種遺傳物質變異多樣性研究可直接反映在DNA分子標記技術的結果上，DNA標記是對遺傳變異的直接反映，且信息豐富，可作為生物種質鑒定的新方法。因此，DNA分子標記技術對遺傳學研究和有關方面的育種起到了有效的推動作用[9]。目前，對中華絨螯蟹群體遺傳多樣性的研究已見相關報道，如胡鵬飛等[10]采取RFLP 技術對長江水系中華絨螯蟹線粒體DNA的遺傳多樣性進行分析。高志千等[11]用RAPD方法分析了遼河、長江和甌江中華絨螯蟹種群的遺傳變異。鄭芳等[12]應用ISSR分子標記技術對天然水域中華絨螯蟹進行遺傳檢測。此外，還有關于中華絨螯蟹在同工酶水平上的遺傳變異[13-14]以及微衛星SSR分析[15]的研究報道。

本研究利用RAPD 和ISSR兩項技術對七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體的遺傳多樣性進行分析，旨在了解七里海中華絨螯蟹的基因庫，為七里海中華絨螯蟹的良種繁育以及中華絨螯蟹現有資源的保護以及開發和利用提供理論依據，同時對RAPD和ISSR兩種分子標記技術進行了比較和探討。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗中分析用樣本為天津市水生動物疫病預防控制中心培育的七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體，隨機選取30只個體，樣本取回后，附肢于95%乙醇保存備用。

1.2 主要試劑和儀器設備

1.2.1 藥品和試劑

無水乙醇：天津市恒昊公司化學試劑廠；Taq酶：生工生物工程(上海)股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：美國Genview公司；100 bp+1.5 kb DNA Marker-K：生工生物工程(上海)股份有限公司；EDTA-2Na：生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白酶K：美國AMRESCO公司；三羥甲基氨基甲烷飽和酚：鼎國生物工程有限公司；三氯甲烷：青島化學試劑廠；異戊醇：青島化學試劑廠；冰乙酸：天津市風船化學試劑科技有限公司；TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)，1 mmol/L EDTA，pH=8.0；瓊脂糖：進口分裝，鼎國生物工程有限公司；上樣緩沖液(6X)：0.25%溴酚藍，40%(m/V)蔗糖水溶液；PCR水(RNase Dnase-free)：生工生物工程(上海)股份有限公司；1×TAE：50×TAE 20 mL,蒸餾水 980 mL；溴酚藍：鼎國生物工程有限公司；引物：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.2 主要儀器和設備

高速離心機(德國 Eppendorf公司，5417R型)，生物安全柜(上海力申科技有限公司，HFsafe 900/C型)，PCR儀(美國MJ Research公司，PTC-200 型)，電泳檢測設備[君意東方電泳設備(北京)有限公司，JY600 型]，凝膠成像分析儀(英國SYNGENE公司，GENEGENIUS型)，電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司，HHS型)，超微量紫外可見分光光度計(德國 IMPLEN公司，P-300 型)。

1.3 試驗方法

1.3.1 總DNA的提取

采用常規酚/氯仿提取方法從七里海中華絨螯蟹的螯肢肌肉中提取總體DNA。

1.3.2 RAPD和ISSR擴增反應體系及反應程序

RAPD和ISSR的擴增反應總體積為25 μL，包括：2.5 μL 10× buffer，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，2 μL引物(5 μmol/L)，0.3 μL Taq plus DNA聚合酶(5 U/μL)，18.7 μL PCR水，1 μL樣本DNA。RAPD引物購自生工上海生物工程股份有限公司。ISSR擴增反應所用50個引物是依據加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的第9套ISSR引物序列(http://www.Michaelsmith.Ubc.a/services/NAPS/ Primer-Sets/Primers)，由生工上海生物工程股份有限公司合成。RAPD擴增PCR循環程序：首先經94 ℃變性5 min后，進行40個擴增循環，每個循環包括94 ℃,1 min;37 ℃,1 min;72 ℃,2 min;最后72 ℃延伸10 min。ISSR擴增PCR循環程序：經95 ℃預變性4 min后，前15個擴增循環，每個循環包括94 ℃ 變性40 s，溫度A退火40 s,72 ℃延伸1.5 min, 后22個循環包括94 ℃變性45 s，溫度B退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用1.8%的瓊脂糖進行電泳檢測(5 V/cm)。將重復性好、擴增條帶清晰的電泳圖譜用于七里海中華絨螯蟹的遺傳多態性分析。

1.3.3 數據分析

電泳檢測后的圖譜利用RAPD分析軟件Quantity One 4.6.2進行分析，選取清晰的擴增片段進行數據統計，將有條帶的記為1，無條帶的記為0，得到0、1矩陣，從而統計位點總數，多態位點數以及多態位點比例等[16]。

香農—維納多樣性指數H0=-∑πilnπi

香農—維納多樣性值H=-∑πilnπi/N

式中，πi為某一條帶在某一群體中出現的頻率，N為所測的總位數。

群體的多態位點百分率/%=該群體的多態位點數/總位點數×100%

群體的多態位點頻率/%=具有該位點的樣本數/總樣本數×100%

2 結果與分析

2.1 RAPD和ISSR引物篩選結果

共用33個RAPD引物和30個ISSR引物對七里海中華絨螯蟹核基因組進行分析，其中21個RAPD引物具有擴增產物，10個引物具有清晰的擴增條帶。8個ISSR引物，擴增條帶清晰，穩定性好，用于進行七里海中華絨螯蟹樣本的遺傳多樣性分析。

2.2 RAPD擴增及數據統計結果

利用10個多態性高的RAPD引物對24個七里海中華絨螯蟹樣本個體進行擴增，引物S97、S397、S376和S83的擴增結果見圖1。統計分析顯示，共檢測出107個不同的擴增位點，擴增片段大小為300～2300 bp。每個引物擴增出多態位點數4～9個，位點總數8～13個。10個引物多態位點百分率為50.00%～72.73%，多態位點總數為66個，平均多態位點百分率為61.32%(表1)。說明RAPD技術用于七里海中華絨螯蟹核基因組的遺傳多樣性分析，具有較高的檢出率和靈敏度。根據多態性位點的基因頻率計算出群體內香農—維納多樣性指數為 18.3419，群體內香農—維納多樣性值為0.1714。可以看出七里海中華絨螯蟹群體的遺傳多態性較高。

圖1 RAPD引物S97、S397、S376、S83在七里海中華絨螯蟹群體中的擴增圖譜注：泳道M為Marker,100 bpDNA標準分子量.下同.

2.3 ISSR擴增結果

利用8個多態性高的ISSR引物對24個七里海中華絨螯蟹樣本個體進行擴增，引物817、835、846和848的擴增電泳圖見圖2。統計分析顯示，共檢測出106個不同的擴增位點，擴增片段大小為200～1500 bp。每個引物擴增出多態位點數7～19個，位點總數為11～21個。8個引物多態位點百分率為53.85%～90.47%，多態位點總數為79個，平均多態位點百分率為74.53%(表2)。由擴增圖譜可見，每個引物在群體的不同個體間均表現出很高的多態性。根據多態性位點的基因頻率計算出群體內香農—維納多樣性指數為18.8425和群體內香農—維納多樣性值為0.1778，可見，七里海中華絨螯蟹表現出豐富的遺傳多樣性。

圖2 ISSR引物817、835、846、848在七里海中華絨螯蟹群體中的擴增圖譜

表1 篩選出的RAPD引物序列及其擴增結果

表2 篩選出的ISSR 引物序列及其擴增結果

3 討 論

七里海中華絨螯蟹是天津寧河縣的特產，因在天津七里海水域生長而以此得名，早在清朝年間就被視為宮廷貢品，百姓對其低脂肪、高蛋白以及獨特的風味更是贊不絕口，2006年12月，國家質檢總局對七里海中華絨螯蟹的地理標志產品保護的申請給予批準[17]。

遺傳多樣性是生物多樣性研究的重要內容，只有通過對遺傳多樣性的研究才能從本質上揭示物種多樣性的起源、變異和進化[18]。平均多態位點比率和香農-維納多樣性指數是衡量生物群體遺傳多樣性高低的參數。RAPD和ISSR分子標記技術是評估遺傳多樣性的一種有效手段，二者以其高度多樣性在物種的遺傳多樣性研究已得到了廣泛的應用[19]。RAPD技術在20世紀90年代末期得到廣泛地應用與發展，其是以PCR技術為基礎的可對整個未知序列核基因組的遺傳多態性進行分析的一種分子標記技術[20]。RAPD 分析技術無需事先了解所要研究生物的核苷酸序列組成，所用引物可隨機地選定與合成，每個RAPD 反應中，僅加單個引物，擴增無特異性，退火溫度較低，因此可保證核苷酸引物與模板DNA的穩定結合，同時允許適當的錯配，使得RAPD 有較高的檢出率，RAPD 分析所需的DNA樣品量極少，RAPD 技術簡便易行、省時省力，易于程序化，利用一套隨機引物便可得到大量的分子標記，并可借助計算機軟件進行相應地統計分析。

我國在20世紀90年代后期[21-28]開始對中華絨螯蟹的分子遺傳學進行研究，應用RAPD技術，對絨螯蟹屬種間[中華絨螯蟹和日本絨螯蟹(E.japonica)]及中華絨螯蟹種群間的親緣關系與分子遺傳標記進行研究。如謝浩等[21]利用RAPD技術對中華絨螯蟹、日本絨螫蟹及日本絨螯蟹合浦亞種3種絨螫蟹親緣關系的研究，發現了區分中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的分子遺傳標記。周開亞等[22]首次應用RAPD標記對中華絨螯蟹種群進行了分子鑒定，在200個隨機引物中，篩選出2個特異性RAPD引物能夠用于長江種群的鑒別。李思發等[23]應用RAPD分析技術，得出遼河與甌江中華絨螯蟹種群的遺傳距離最大(0.171)。邱濤等[24-25]用RAPD 方法分析了遼河、長江和甌江種群的遺傳變異，并用RAPD技術識別中華絨螯蟹性別差異，發現17個引物擴增出了群體水平的性別差異，篩選出一個引物擴增出了個體水平的性別差異。趙姝華等[26]采用RAPD技術對中華絨螯蟹同一來源的不同個體進行遺傳差異分析，初步得出個體間遺傳變異在20%以下，同源程度達80%以上。

ISSR方法是基于 SSR 基礎上的一種分子標記手段，該技術利用錨定引物擴增微衛星位點之間的區域，與RAPD相比，其每條引物可產生更多的多態性條帶[29]。相較于RAPD標記在中華絨螯蟹方面的研究，ISSR標記在中華絨螯蟹種質研究中的報道并不多見。鄭芳等[12]采用ISSR 技術鑒定4個水系(鴨綠江、長江、閩江和南流江)中華絨螯蟹，共獲得80條清晰穩定的條帶，其中有53條多態性條帶，多態率為66.25%。

本研究利用10條RAPD引物和8條ISSR引物分別對七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體進行了總 DNA 的基因擴增，且兩種分子標記技術均能擴增出清晰、穩定的條帶。由研究結果可以看出，RAPD和ISSR兩種標記方法獲得的每條引物多態性位點的平均值分別為6.60個和 9.88 個，多態性條帶百分率的平均值分別為61.32%和 74.53%。但兩種分子標記技術所表現出的物種的遺傳信息不盡相同，可見，七里海中華絨螯蟹存在豐富的遺傳多樣性。

遺傳多樣性是指存在于生物個體間、單個物種間以及物種之間的基因多樣性[30]。一種生物的遺傳變異越突出、越多樣性，它對環境的適應能力越強，同時一個物種對環境的適應能力越強它的進化潛力也就越大。群體的香農—維納多樣性值是衡量群體遺傳多樣性的重要指標，此數值越大則表明該物種的遺傳多樣性越高，對環境的適應能力也就越強。根據多態性條帶的基因頻率分別計算出RAPD和ISSR標記技術群體內香農—維納多樣性指數為 18.3419和18.8425，群體內香農—維納多樣性值為0.1714和0.1778。可見，七里海中華絨螯蟹第6代繁育群體具有較高的遺傳多態性。電泳圖譜可知，每個引物在該群體中，均表現出很高的多態性，同時也說明了RAPD和ISSR標記技術可以成功地對七里海中華絨螯蟹核基因組DNA進行擴增并進行遺傳多樣性分析。兩種標記技術均能得到各自的的多態性條帶，但是所呈現的多態性和檢測水平各不相同，因此，結合RAPD和ISSR兩種標記技術獲得的七里海中華絨螯蟹遺傳多樣性信息更全面客觀。

[1] 馬成學, 李曉東, 王曉梅, 等. 絨螯蟹線粒體細胞色素b基因的RFLP分析[J]. 天津師范大學學報, 2006, 26(3)：23-27.

[2] 李思發, 工成輝, 趙乃剛. 湖泊放養長江水系中華絨螯蟹的性成熟規律研究[J]. 水生生物學報, 2001, 25(4)：251-257.

[3] 許步邵. 河蟹養殖技術[M]. 北京：金盾出版社, 1987：36-51.

[4] 張德隆, 杜小燕, 趙金利, 等. 河蟹性早熟成因及控制方法的研究[J]. 淡水漁業, 2001, 31(4)：36-39.

[5] 劉偉. 長江水系河蟹不同家系一齡蟹種生長的比較研究[D]. 上海:上海海洋大學, 2010.

[6] 谷孝鴻, 趙福順. 長江中華絨螯蟹的資源與養殖現狀及其種質保護[J]. 湖泊科學, 2001, 13(3)：267-271.

[7] 彭武漢.中華絨螯蟹種群在珠江流域變異問題的初步探討[J]. 水產科技情報, 1986, 13(2)：32-42.

[8] 張秀梅, 柳廣東, 高天翔. 絨螯蟹種質資源研究進展[J].青島海洋大學學報, 2002, 32(4)：533-542.

[9] 朱顏, 周國利, 吳玉厚, 等. 遺傳標記的研究進展和應用[J]. 延邊大學農學學報, 2004, 26(1)：64-69.

[10] 胡鵬飛, 王茜, 戴偉, 等. 長江水系中華絨螯蟹線粒體DNA的遺傳多樣性研究[J]. 水產學雜志, 2006, 19(1)：1-5.

[11] 高志千, 周開亞. 中華絨螯蟹遺傳變異的RAPD分析[J].生物多樣性, 1998, 6(3)：186-190.

[12] 鄭芳, 呂秀玲, 孫紅英, 等. ISSR標記在河蟹種質檢測中的應用[J].中國水產科學, 2007, 14(1)：46-51.

[13] 喬新美, 曹維孝, 鄒世平. 長江、甌江中華絨螯蟹幾種同工酶的分析比較[J]. 淡水漁業, 1994, 24(5)：10-13.

[14] Li G,Shen Q, Xu Z. Morphometric and biochemical genetic variation of the mitten crab,Eriocheir, in southern China [J]. Aquaculture, 1993,111(1/4)：103-115.

[15] Sui L Y, Zhang F M, Wang X M. Genetic diversity and population structure of the Chinese mitten crabEriocheirsinensisin its native range[J]. Mar Biol, 2009, 156(8)：1573-1583.

[16] Wachira F N, Waugh R, Hackett C A, et al. Detection of genetic diversity in tea(Camelliasinensis) using RAPD markers[J]. Genome, 1995, 38(7)：201-210.

[17] 國家質量監督檢驗檢疫總局網.關于批準對七里海河蟹實施地理標志產品保護的公告[EB/OL].2006-12-22. [2015-09-16]http://www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/jlgg_12538/zjgg/2006/200701/t20070118_315367.htm.

[18] Ayliffe M A,Lawrence G J,Ellis J G,et al. Hetero-duplex molecules formed between allelic sequences cause nonparental RAPD bands[J]. Nucleic Acids Research,1994, 22(9):1632-1636.

[19] Karp A, Edwards K J. Molecular technologies in the analysis of the extent and distribution of genetic diversity, IPGRI Workshop on molecular genetic tools in plant genetic resources[M]. Rome：IPGRI, 1995.

[20] 周孟嬌, 劉臻. RAPD 技術及其在蝦、蟹類研究中的應用[J]. 水產科技情報, 2003, 30(1)：25-28.

[21] 謝浩, 陸仁后, 項超美, 等. 利用RAPD技術對三種絨螯蟹親緣關系的研究[J]. 水生生物學報, 1999, 23(2)：120-125.

[22] 周開亞, 高志千. RAPD 標記鑒別中華絨螯蟹種群的初步研究[J]. 應用與環境生物學報, 1999, 5(2)：176-180.

[23] 李思發, 鄒曙明. 中國大陸沿海6水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體親緣關系：RAPD指紋標記[J]. 水產學報, 1999, 23(4)：325-330.

[24] 邱濤, 陸仁后, 項超美, 等. RAPD 方法對中華絨螯蟹長江、遼河、甌江三群體的遺產多樣性分析[J]. 淡水漁業, 1997, 27(5)：3-6.

[25] 邱濤, 陸仁后, 項超美, 等. 用RAPD技術識別中華絨螯蟹性別差異[J].水產學報,1998, 22(2)：175-177.

[26] 趙姝華, 張勝利, 溫恩濤, 等. 中華絨螯蟹RAPD擴增條件及個體間遺傳差異[J].水產科學, 1998, 17(5):3-6.

[27] 項超美, 陸仁后, 謝浩, 等. 四種十足目甲殼動物遺傳差異的RAPD分析[J].水生生物學報, 1998, 22(3)：251-256.

[28] Wolfe A D, Xiang Q Y, Kephart S R. Assessing hybridization in natural populations ofPenstemon(Scrophulariaceae) using hypervariable intersimple sequence repeat (ISSR) bands[J]. Molecular Ecology, 1998, 7(9)：1107-1125.

[29] 丁淑燕, 黃亞紅, 柏如發, 等. 江蘇及安徽地區十個中華絨螯蟹成蟹群體的RAPD分析[J].水產科學, 2008, 27(8)：418-420.

[30] 龐廣昌, 姜冬梅. 群體遺傳多樣性和數據分析[J]. 林業科學, 1995, 31(6)：543-550.

AnalysisofGeneticDiversityofChineseMittenHandedCrabEriocheirsinensisfromQilihaibyRAPDandISSRMarkers

SHI Hongyue1，LIU Yang1，WANG Xiaomei1，GAO Jinwei1，QIU Linshan1，LI Jingjing2

( 1.Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture, College of Fisheries,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2.Tianjin Aquatic Animal Infectious Disease Control and Prevention Center, Tianjin 300402, China )

Two types of molecular markers, namely, Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) were used to detect the genetic diversities at the intra sixth generation breeding population of Chinese mitten handed crabEriocheirsinensisfrom Qilihai. Using 10 RAPD primers selected from 33 primers, a total of 107 amplified loci ranging from 300 to 2300 bp were observed from 24 individuals, and 66 of 107 loci detected were polymorphic with the percent of 61.32%, and the Shannon′s index of 18.3419. Eight ISSR primers of 50 primers used generated 106 reproducible and stable bands, ranging from 200 to 1500 bp, 79 of 107 loci detected were polymorphic with the percent of 74.53%, and the Shannon′s index of 18.8425. These findings indicated that the sixth generation breeding population had high genetic diversity, and that the proportion of polymorphic loci and Shannon′s index of Qilihai Chinese mitten handed crab were high, indicating that they have abundant genetic diversity.

Eriocheirsinensisin Qilihai； genetic diversity; RAPD; ISSR

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.011

S917

A

1003-1111(2016)03-0255-06

2015-09-16；

2015-11-10.

天津市水產局科技發展計劃項目(J2013-21).

石洪玥(1986-)，女，助理實驗師；研究方向：水產養殖學.E-mail：youyan_shy@126.com.通訊作者：王曉梅(1962-)，女，教授；研究方向：水產動物遺傳育種及分子生物學.E-mail： xiaomeiw@tjau.edu.cn.