高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜測定楊樹膠的指標性成分水楊苷

趙曉亞，付曉芳，李 晶，王 鵬，葉 誠，尚吟竹，鄭茜玥

(湖北出入境檢驗檢疫局技術中心，湖北 武漢 430050)

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高效液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜測定楊樹膠的指標性成分水楊苷

趙曉亞*，付曉芳，李 晶，王 鵬，葉 誠，尚吟竹，鄭茜玥

(湖北出入境檢驗檢疫局技術中心，湖北 武漢 430050)

建立了液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜(LC-LTQ-Orbitrap)快速測定蜂膠中楊樹膠指標性成分水楊苷含量的方法，并根據精確的母離子和子離子質荷比進行定性和確證，以判斷蜂膠中是否摻雜楊樹膠。樣品經無水乙醇提取，Waters xselect HSS T3色譜柱(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)分離，以乙腈-0.1%乙酸溶液為流動相，正離子掃描模式進行高分辨質譜檢測，外標法定量。結果表明，該方法的線性范圍為0.5～25.0 μg/mL，相關系數(r)大于0.99。在25.0，150.0，300.0 mg/kg 3個加標水平下的平均回收率為81.6%～91.0%，相對標準偏差為9.0%～11.6%。

高效液相色譜;線性離子阱-靜電場軌道阱;高分辨質譜;蜂膠;楊樹膠;水楊苷

GB/T 24283-2009[1]定義蜂膠為“工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠粘性物質”。蜂膠具有廣泛的藥理活性和功效，有抗菌、降血糖、抗炎鎮痛、增強免疫、抗氧化、抗衰老等作用[2-4],因此蜂膠產品越來越受到消費者青睞，原料需求顯著增加，出現了以楊樹膠混入蜂膠中的造假問題。由于蜂膠來源于植物樹脂，尤其是楊屬性蜂膠主要來源于楊屬植物，因此為鑒別蜂膠和楊樹膠帶來了難度。

目前對蜂膠真假鑒別的方法主要有液相色譜法[5-12]、氣相色譜法[13]、氣相色譜-質譜聯用法[14-16]等。GH/T1081-2012中明確指出水楊苷廣泛存在于楊屬和柳屬植物的芽、葉子和樹皮中，西方蜜蜂在采集楊屬植物樹脂以及蜂巢內傳遞這些樹脂加工成蜂膠的過程中加入了其腺體分泌的β-葡萄糖苷酶等，將樹脂中所含有的水楊苷水解。但在楊樹膠加工過程中水楊苷能穩定存在。因而水楊苷是區分蜂膠與楊樹膠的有效指標。本文借鑒此標準，采用定性更準確的高分辨質譜，對鑒別蜂膠與楊樹膠的特征化合物水楊苷進行測定，建立了對蜂膠中水楊苷定性、定量分析的液相色譜-線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜(LC-LTQ-Orbitrap)法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Scientific 線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜儀LTQ-Orbitrap XL(賽默飛世爾科技公司)，液相系統為Finnigan Surveyor液相色譜帶自動進樣器;Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);KQ-600B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);MS2型旋渦振蕩器(德國IKA公司);AB204-S型電子天平(美國Mettler Toledo公司)。

水楊苷(Salicin，CAS 138-52-3，分子式C13H18O7) 購自Fluka公司,純度≥98.5%。甲醇、乙腈和無水乙醇(色譜純，德國Merck公司);乙酸(分析純);實驗用水為Millipore系統制備的超純水。蜂膠、楊樹膠購于湖北蜂農。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取水楊苷標準品10.0 mg 于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為1.0 g/L的標準儲備液。分別移取適量的上述儲備液于一系列10 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，配制成一系列不同質量濃度的混合標準工作液。

1.3 樣品前處理

樣品在冰箱-10 ℃左右過夜，從冰箱中取出后立即攪碎混勻，在室溫下，準確稱取蜂膠或楊樹膠樣品0.500 g于25 mL容量瓶內，加入20 mL無水乙醇，超聲使樣品完全溶解后，用無水乙醇定容。取1.0 mL提取液過0.22 μm濾膜，供測定。

1.4 儀器條件

色譜柱：Waters xselect HSS T3(3.0 mm×100 mm，3.5 μm);流動相：0.1%乙酸溶液(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序為：0～3 min，95% A，3～8 min，95%～40% A，8～15 min，40%～1% A，15～20 min，1% A，20～21 min，1%～95% A，21～30 min，95% A;流速 0.2 mL/min;進樣量5 μL，柱溫20 ℃。

質譜條件：質量分析器為FT Orbitrap，ESI(+)正離子模式掃描，質量范圍(m/z)為100～500，分辨率為60 000，噴霧電壓為4.5 kV，管狀透鏡電壓為80 V，鞘氣壓力為35 arb，輔助氣壓力為5 arb。

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇

根據資料，蜂膠的提取通常采用甲醇、一定比例的乙醇溶液或無水乙醇，本實驗比較了甲醇和乙醇作為提取溶劑的提取效率。實驗發現，以甲醇作為提取溶劑時，溶解樣品比乙醇作為提取溶劑時難，而且無水乙醇對樣品中水楊苷的提取效率更高(對同一楊樹膠分別采用乙醇和甲醇提取，測得進樣液中水楊苷的峰面積分別為882 091和204 184)，故采用無水乙醇為提取溶劑。

2.2 流動相的選擇

對比了流動相體系分別為10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈、10 mmol/L乙酸銨(含0.1%甲酸)-甲醇、0.1%乙酸-乙腈和0.1%乙酸-甲醇時對被測化合物分離及峰形的影響。結果表明，水楊苷在乙酸銨流動相體系的響應低于乙酸流動相體系;用0.1%乙酸-乙腈流動相時，水楊苷會出現雙峰，而以0.1%乙酸-甲醇為流動相時出峰情況得到改善，峰變為單一峰，但峰形很差，展寬嚴重。分別優化了0.1%乙酸-乙腈和0.1%乙酸-甲醇兩種流動相體系的洗脫梯度，發現0.1%乙酸-乙腈溶液的洗脫效果隨著梯度的調整，出現雙峰的情況得到改善，在“1.4”所示的優化流動相條件下，得到了單一的色譜峰(圖1)。

Fig.1 Chromatograms of salicin standard solution in optimal mobile phase

A.full scan spectrum;B.extracted ion chromatogram

圖2 水楊苷的質譜圖Fig.2 Full scan mass spectrum of salicin

2.3 質譜條件的優化以及二級裂解

水楊苷的精確分子量為286.105 255，[M+H]+的精確質量為287.113 080，[M+Na]+的精確質量為309.095 022，[M+K]+的精確質量為325.068 962。在全掃描模式下，對水楊苷標準溶液在m/z280～335范圍內進行掃描，結果顯示水楊苷的[M+H]+響應非常低，而[M+Na]+響應很好，進一步優化鞘氣電壓和輔助氣電壓，可使被測物[M+Na]+的響應提高。質譜圖見圖2。圖3給出了[M+Na]+離子在碰撞誘導解離(CID)

圖3 水楊苷的二級裂解譜圖

Fig.3 CID mass spectra of salicin in different energy

和高能碰撞誘導解離(HCD)裂解模式及不同能量下的二級質譜圖。在HCD模式下，碰撞能量20 eV和40 eV時水楊苷特征碎片離子少，提高碰撞能量達50 eV時，無特征碎片離子；CID模式下，水楊苷的二級特征離子穩定，碎片離子的特征峰在40 eV和60 eV碰撞能量下無明顯區別，碎片離子(m/z)主要為279.083 7，185.041 8和147.041 4。本方法采用自動觸發二級質譜采集，并用ToxID篩選軟件建立化合物的分子式數據庫信息表，化合物篩選的離子提取窗口寬度為5 ppm。指定離子加合物類型為[M+Na]+，通過二級碎片離子(m/z) 279.083 7，185.041 8和147.041 4的設定，增加了檢測的準確性。

2.4 線性范圍、檢出限、回收率及精確度

分別配制濃度為0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，25.0 μg/mL的系列水楊苷標準溶液，按照所建立的分析方法進行測定，以目標組分的峰面積(y)對相應的進樣濃度(x，μg/mL)繪制標準曲線，計算得到水楊苷在0.5～25.0 μg/mL范圍內的線性方程為y=4.438 65×106x+9.072 03×106，相關系數(r2)為0.995。采用空白樣品中添加水楊苷的方法，以3倍信噪比(S/N)計算得方法檢出限為25.0 mg/kg。

稱取蜂膠試樣0.500 g，分別加入25.0，150.0，300.0 mg/kg 3種濃度水楊苷標準溶液，每個濃度平行測定6份，結果表明，3種添加濃度的平均回收率分別為81.6%,91.0%和89.9%，相對標準偏差(RSD)分別為11.6%,9.8%和9.0%。由于蜂膠會用楊樹膠摻假，而水楊苷是楊樹膠的特征成分，若蜂膠中摻有楊樹膠，會有水楊苷的檢出。稱取蜂膠試樣0.500 g，添加2.5%,5%,10%楊樹膠，每個濃度平行10份，均檢出水楊苷。樣品蜂膠、楊樹膠、蜂膠添加水楊苷標準溶液以及蜂膠添加楊樹膠的譜圖見圖4。

圖4 蜂膠(A)、楊樹膠(B)、蜂膠添加25.0 mg/kg水楊苷(C)以及蜂膠添加5%楊樹膠(D)的提取離子色譜圖

Fig.4 Extracted ion chromatograms of propolis(A)，poplar tree gum(B),25.0 mg/kg salicin spiked in propolis(C) and 5% poplar tree gum spiked in propolis(D)

2.5 實際樣品的檢測

蜂膠樣品按本方法進行前處理，采用優化后的LC-LTQ-Orbitrap條件進行定性和定量分析。結果在部分蜂膠樣品中檢出水楊苷，有些樣品超過GH/T1081-2012(若蜂膠樣品中水楊苷含量大于0.15 mg/g或蜂膠乙醇提取物樣品中水楊苷含量大于0.25 mg/g，該樣品判定為檢出楊樹膠的樣品)規定的0.15 mg/g的限量，說明在日常的蜂膠生產中存在摻雜楊樹膠的現象。

3 結 論

本文將線性離子阱-靜電場軌道阱高分辨質譜(LTQ-Orbitrap)技術引入蜂膠摻假鑒別檢測，采用高分辨質譜，在進行母離子準確定性定量的同時，增加高分辨的二級質譜，提高了定性準確性，更有利于排除干擾，可在不具備標準物質的情況下進行確證。該方法具有準確、快速的特點，可用于日常蜂膠中楊樹膠的鑒別檢測。

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Determination of Salicin,a Characteristic Component of Poplar Tree Gumby HPLC-LTQ-Orbitrap High Resolution Mass Spectrometry

ZHAO Xiao-ya*，FU Xiao-fang，LI Jing，WANG Peng，YE Cheng，SHANG Yin-zhu，ZHENG Xi-yue

(Hubei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Wuhan 430050，China)

A method of high performance liquid chromatography(HPLC) combined with LTQ-Orbitrap XL mass spectrometry was developed for the analysis of salicin,a characteristic component of poplar tree gum in propolis.With the exact parent ion and fragment ion， whether the propolis contains poplar tree gum could be confirmed.The samples were extracted with ethyl alcohol.The LC separation was performed on a Waters xselect HSS T3(3.0 mm×100 mm，3.5 μm) column with acetonitrile-0.1% acetic acid solution as mobile phase.The analyte was detected under positive mode.The calibration curve showed a good linearity within the concentration range of 0.5-25.0 μg/mL.The average recoveries of salicin ranged from 81.6% to 91.0% at the spiked levels of 25.0，150.0，300.0 mg/kg with relative standard deviations(RSDs) less than 11.6%.The developed method was simple，sensitive and repeatable，and could be used as a screen and confirmatory approach for the analysis of salicin in propolis.

high performance liquid chromatography(HPLC);linear ion trap-orbitrap mass spectrometer(LTQ-orbitrap MS);high-resolution mass spectrometry(HRMS);propolis;poplar tree gum;salicin

2015-09-06;

2015-10-08

國家質量監督檢驗檢疫總局科研項目計劃(2013IK156)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.03.015

O657.72

A

1004-4957(2016)03-0342-05

*通訊作者：趙曉亞,博士,高級工程師,研究方向:食品安全檢測，Tel：027-58906069，E-mail：zhaoxy@hbciq.gov.cn