金烏散對小鼠免疫功能的影響

樊宏亮 ， 郝欣蔚 ， 吳燁挺 ， 張 雪 ， 趙紅霞

(1.內蒙古農業大學獸醫學院 ， 內蒙古呼和浩特010018 ；2.內蒙古伊利實業集團股份有限公司 ， 內蒙古呼和浩特010080)

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金烏散對小鼠免疫功能的影響

樊宏亮1，2， 郝欣蔚1， 吳燁挺1， 張 雪1， 趙紅霞1

(1.內蒙古農業大學獸醫學院 ， 內蒙古呼和浩特010018 ；2.內蒙古伊利實業集團股份有限公司 ， 內蒙古呼和浩特010080)

為了對金烏散中藥復方進行實驗室藥效學評價，我們開展了金烏散對小鼠免疫功能影響的研究。本試驗采用碳廓清法測定金烏散對單核巨噬細胞吞噬功能的影響；采用比濁法測定金烏散對小鼠血清中溶酶菌含量的影響；采用遲發型皮膚變態反應法測定金烏散對小鼠遲發型皮膚過敏反應的影響；采用血清溶血素法測定對綿羊紅細胞所致的小鼠溶血素抗體生成的影響。研究結果顯示，金烏散對單核巨噬細胞的吞噬功能有顯著的抑制作用，并能顯著提高溶酶菌的含量，對遲發型皮膚過敏反應也有顯著的抑制作用，而且能增加溶血素的含量。因此，該中藥組方可影響小鼠的非特異性免疫功能和特異性免疫功能。

金烏散免疫作用 ； 小鼠

金烏散中藥復方是針對呼和浩特周邊地區奶牛子宮內膜炎主要病原菌，以體外抑菌強度為測定指標，按照中獸醫理論，采用正交試驗，篩選出的具有良好抗菌作用的中藥處方。其基礎組方主要由金銀花、烏梅、蒲公英等組成，各味中藥相互配伍、協同，再加上各種輔藥具有較強的抗炎作用。為了更加系統研究金烏散抗炎機理與免疫調節之間的聯系，本課題從溶酶菌含量、遲發型皮膚過敏反應、溶血素抗體、碳廓清能力等方面研究了金烏散對小鼠非特異性免疫功能和特異性免疫功能的影響，旨在為金烏散的臨床藥效學研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 金烏散：以金銀花、烏梅、連翹、蒲公英為主藥并配以其他輔藥、矯正藥組合而成，經過實驗室工藝制備，并將該中藥制劑調整至濃度1.0 g/mL，放到4 ℃冰箱保存備用；地塞米松磷酸鈉注射液：天津藥業焦作有限公司生產，批號08051211；印度墨汁：北京市西中化工廠，批號為020809；20%綿羊紅細胞懸液，由健康綿羊血制備而成。PBS 緩沖液，按文獻[3-4]方法自行配制；Alsever溶液，按文獻[1]方法自行配制。

1.2 動物 豚鼠：體重400±50 g，雄性，由內蒙古生物制藥廠提供；清潔級純種昆明系小鼠：體重18±2 g，雌雄各半，由內蒙古大學實驗動物中心提供；綿羊：由內蒙古農業大學獸醫學院提供。

1.3 菌株 騰黃微壁鏈球菌：代號為1.634，由中國醫學科學院微生物研究所提供。

1.4 方法

1.4.2 金烏散對小鼠血清中溶菌酶含量的影響 采用比濁測定法[6]，首先制備試驗用騰黃微壁鏈球菌菌懸浮液。接種菌種，置37 ℃恒溫培養箱內培養，洗下菌苔，3 000 r/min 離心10 min，棄上清液，菌體用PBS洗3次，于波長600 nm比色。其次制備溶菌酶標準應用液。配成每毫升緩沖液中含有溶菌酶1 mg的原液，然后稀釋成濃度為1、2、3、4、6 μg/mL 的標準應用液。最后測定樣品。分組：給藥劑量、給藥途徑同“1.4.1 分組及給藥”。末次給藥1 h 后，在無菌條件下采血，分離血清。取溶菌酶標準應用液及標本各0.1 mL，每管加基質液4 mL混勻，置40 ℃水浴2 min，立即混懸，用600 nm波長測t值，以騰黃溶壁鏈球菌濁度的變化在標準曲線上查出溶菌酶的活性值(即溶菌酶的濃度)。1.4.3 金烏散對小鼠遲發型皮膚過敏反應的影響 采用遲發型皮膚變態反應法[3]進行試驗。分組和給藥方法同1.4.1。給藥前用7% 2、4-二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液以0.02 mL/只鼠背部皮內注射致敏，連續給藥11 d。末日給藥1 h 后將1%DNCB 丙酮溶液0.02 mL/只涂于各小鼠右耳，24 h后處死，用直徑為7 mm 的打孔器將兩耳取下，分別稱重，兩耳的重量差為皮膚過敏反應強度的觀測指標。同時取脾臟，稱其鮮重，按公式計算脾臟指數，脾臟指數=脾臟質量/體重。

1.4.4 金烏散對綿羊紅細胞所致的小鼠溶血素抗體生成的影響 采用血清溶血素法測定[1,6]。分組和給藥方法同1.4.1。首先，制備綿羊紅細胞懸液(SRBC)和豚鼠補體血清，按文獻[3]的方法進行。其次，給小鼠免疫及給藥。連續給藥7 d，于第2次給藥后腹腔注射20%SRBC0。2 mL/鼠。于免疫后5 d，眼球取血，離心分離血清。最后測定溶血量。將血清稀釋，在本試驗中以1∶ 400 倍稀釋作為正式試驗的血清稀釋度。吸取1∶ 400 倍稀釋的血清各0.5 mL，依次加入其他試劑，混勻，溫育1 h，冰浴5 min 終止反應，3 000 r/min 離心10min，取上清液于540 nm 處測定OD值，并按下列公式計算出溶血素含量。溶血素含量=樣本血清的OD值×稀釋倍數

1.4.5 數據統計分析 采用SPSS 統計軟件，對所有數據進行顯著性檢驗，并進行分析比較，數據以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 金烏散對小鼠體內的單核—巨噬細胞吞噬功能的影響 采用碳廓清法[3-5]測定金烏散對小鼠體內的單核—巨噬細胞吞噬功能的影響，并對數據進行統計分析，試驗結果見表1。

表1 金烏散對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

組別劑量(g/kg)碳廓清指數K吞噬系數α陰性對照組200.0254±0.00132a4.805±0.4036a陽性對照組0.0050.0143±0.00105c4.117±0.3913c高劑量組200.0246±0.00194a4.768±0.3745a低劑量組100.0205±0.00213b4.451±0.2056b

注：相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；相鄰字母表示差異顯著(P<0.05)；相間字母表示差異極顯著(P<0.01)，下表同

以上試驗結果表明，低劑量的金烏散對小鼠體內單核-巨噬細胞的吞噬功能具有顯著地抑制作用，而高劑量的金烏散則無明顯作用。

2.2 金烏散對小鼠血清中溶菌酶含量的影響 采用比濁測定法[7]檢測各組小鼠血清中溶菌酶含量，并進行統計分析，結果見表2。

表2 金烏散對小鼠血清溶菌酶含量的影響 ±s)

以上試驗結果表明，高劑量的金烏散能極顯著的提高小鼠血清中溶菌酶含量，而低劑量的金烏散也可提高小鼠血清中溶菌酶的含量，但是其作用不顯著。

2.3 金烏散對小鼠遲發型皮膚過敏反應的影響

采用變態反應法[3]檢測各組小鼠耳殼腫脹度，計算脾指數，并進行統計分析，結果見表3。

表3 金烏散對小鼠兩耳重量差和脾指數的影響±s)

以上試驗結果表明，高、低劑量的金烏散對小鼠遲發型皮膚過敏反應均有顯著抑制作用，而且高劑量的金烏散對小鼠遲發型皮膚過敏反應有極顯著的抑制作用。

2.4 金烏散對綿羊紅細胞所致的小鼠溶血素抗體生成的影響 采用血清溶血素分光光度法[3-4]。檢測各組小鼠血清抗綿羊紅細胞抗體，并進行統計分析，結果見表4。

以上試驗表明，高、低劑量的金烏散均能顯著增加小鼠血清中溶血素的含量；而作為陽性對照的地塞米松則可導致小鼠血清溶血素含量顯著降低。

表4 金烏散對小鼠血清溶血素含量的影響 ±s)

3 小結和討論

巨噬細胞的吞噬、殺傷、抗原加工和呈遞、合成和分泌各種活性因子的功能使得巨噬細胞在免疫方面起著相當重要的作用。另外巨噬細胞是機體非特異性免疫的標志物之一[2]。碳粒廓指數可以很好的反映機體巨噬細胞的吞噬功能。本試驗中發現小劑量的金烏散對小鼠碳粒清水平有一定的抑制作用，而隨劑量增加，抑制作用減弱甚至消失。溶菌酶作為機體非特異性免疫因子之一，參與機體多種反應，本試驗結果表明，金烏散能提高小鼠血清中溶菌酶含量，且呈現一定的劑量相關性。

遲發型變態反應是第Ⅳ型變態反應又稱接觸過敏反應。研究表明，金烏散對小鼠遲發型皮膚過敏反應有顯著抑制作用，且隨著劑量的增加呈現顯著的增強作用。血清溶血素的測定可以反映機體的體液免疫狀態[8]，用藥后，高、低劑量的金烏散均可使小鼠血清溶血素生成增多，表明機體體液免疫功能增強。綜上所述，金烏散對單核-巨噬細胞的吞噬功能有顯著的抑制作用，并能顯著提高溶酶菌的含量，對遲發型皮膚過敏反應也有顯著的抑制作用，而且能增加溶血素的含量。因此，該中藥組方可影響小鼠的非特異性免疫功能和特異性免疫功能，通過調節機體的免疫系統從而調節機體的免疫功能。

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2015-07-14

內蒙古農業大學博士啟動基金

樊宏亮(1972-)，男，高級獸醫師，碩士，從事獸醫臨床學研究，E-mail：fanhongliang@yili.com

趙紅霞，E-mail：bluehongxia@126.com

S853.72

B

0529-6005(2016)10-0057-03