甘肅不同地域伏毛鐵棒錘中烏頭堿及3-乙酰烏頭堿的含量分析*

馬新?lián)Q，郭 敏，喬 莉，肖正國(guó)

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

甘肅不同地域伏毛鐵棒錘中烏頭堿及3-乙酰烏頭堿的含量分析*

馬新?lián)Q，郭 敏，喬 莉，肖正國(guó)

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

目的：分析甘肅不同地域伏毛鐵棒錘中烏頭堿及3-乙酰烏頭堿的含量差異。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為 G em i ni-N x-C18柱(5 μm，4.6 m m×250mm)，以乙腈：0.2%碳酸氫銨溶液(55:45)為流動(dòng)相，流速為1.0 m L/m i n，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫：30℃進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：烏頭堿線性范圍為：19.20～57.55 μg/m L，平均加樣回收率為101.30%，(RSD=2.34%)；3-乙酰烏頭堿線性范圍為：4.8～50 μg/m L，平均加樣回收率為100.67% (RSD=0.77%)。結(jié)論：該法快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于伏毛鐵棒錘中烏頭堿及3-乙酰烏頭堿的含量測(cè)定及差異分析。

伏毛鐵棒錘；甘肅；烏頭堿；3-乙酰烏頭堿；含量分析

伏毛鐵棒錘為毛茛科烏頭屬植物(Aconitum f lavum Hand.-Mazz.)的干燥塊根，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥(第一冊(cè))［1］。伏毛鐵棒錘為藏族習(xí)用藥材，在我省分布廣泛，具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛、散瘀的功效，主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛、跌打瘀痛、毒熱、腫瘤等疾病的治療。現(xiàn)代藥理研究表明［2-4］：伏毛鐵棒錘的有效成分為烏頭生物堿類，其生物堿具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎、局麻、解熱及致心律失常作用，其中烏頭堿、3-乙酰烏頭堿、去氧烏頭堿為鐵棒錘的主要有效成分，是其藥理作用的基礎(chǔ)。本研究通過(guò)RP-HPLC法測(cè)定甘肅四個(gè)地域伏毛鐵棒錘中烏頭堿、3-乙酰烏頭堿的含量，考察有效成分與地域的相關(guān)性，為伏毛鐵棒錘藥材的質(zhì)量控制和臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 2695高效液相色譜儀，包括2998PDA紫外檢測(cè)器，2695中文色譜工作站；2695自動(dòng)進(jìn)樣器。

1.2 試藥 伏毛鐵棒錘藥材由甘肅省甘南藏醫(yī)藥研究院提供，烏頭堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)：110798-200805，供含量測(cè)定用)，3-乙酰烏頭堿對(duì)照品(上海佰世凱化學(xué)科技有限公司提供，CAS：77181-26-1，含量達(dá)到98%以上)，乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑為分析純。

1.3 方法［5-12］

1.3.1 色譜條件 色譜柱：色譜柱Gemini-Nx-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相：0.2%碳酸氫銨溶液(55:45)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按烏頭堿計(jì)算，應(yīng)不得低于4 000。在此色譜條件下，樣品分離良好，烏頭堿(A)色譜峰保留時(shí)間tR=9.8分鐘，3-乙酰烏頭堿(B)色譜峰保留時(shí)間tR=31.6分鐘，HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品及樣品H PLC色譜圖

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷干燥器中真空干燥至恒重的烏頭堿對(duì)照品8 mg、3-乙酰烏頭堿對(duì)照品2 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解、定容至刻度，搖勻，得到烏頭堿對(duì)照品溶液濃度為800 μg/mL，3-乙酰烏頭堿對(duì)照品溶液濃度為200 μg/mL，備用。

1.3.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密吸取烏頭堿對(duì)照品溶液和3-乙酰烏頭堿對(duì)照品溶液各3 mL，混合于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。進(jìn)樣前用C18色譜預(yù)柱過(guò)濾。

1.3.4 供試品溶液的制備 取伏毛鐵棒錘藥材粉碎成粗粉，取約2.50 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加100 mL甲醇，加熱回流提取2小時(shí)，濾過(guò)，濾液體積濃縮至20 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL至5mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰。以各成分吸收度(A)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，烏頭堿線性回歸方程：A=0.000 21C+0.001 74，r=0.999 0，線性范圍為：19.20～57.55 μg/mL；3-乙酰烏頭堿線性回歸方程：A=0.000 55C-0.009 2，r=0.998 5，線性范圍為：4.8～50 μg/mL。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密移取同一濃度的混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定峰面積值，結(jié)果烏頭堿峰面積的RSD為0.88%，3-乙酰烏頭堿峰面積的RSD為1.22%。表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密移取同一濃度的混合對(duì)照品溶液，分別于0、3、5、6、7小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定峰面積值，結(jié)果烏頭堿峰面積的RSD為0.97%，3-乙酰烏頭堿峰面積的RSD為1.11%，結(jié)果表明，樣品溶液在7小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，可以進(jìn)行含量測(cè)定。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取甘肅臨夏同一批伏毛鐵棒錘藥材適量，按供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，測(cè)定峰面積值，結(jié)果烏頭堿和3-乙酰烏頭堿的平均含量分別為 210.08 mg/g、22.02 mg/g，RSD分別為2.23%和1.97%結(jié)果表明，方法重現(xiàn)性良好。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 取已知烏頭堿和3-乙酰烏頭堿含量的伏毛鐵棒錘藥材12份，每份約2.50 g，等分為2組，精密稱定，分別精密加入適量的烏頭堿對(duì)照品和3-乙酰烏頭堿對(duì)照品，按“1.3.4”項(xiàng)下制備方法平行制備，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。烏頭堿的平均加樣回收率為101.30%，RSD%=2.34%；3-乙酰烏頭堿的平均加樣回收率為100.67%，RSD%=0.77%。表明實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確，見(jiàn)表1。

2.6 樣品測(cè)定 取各產(chǎn)地伏毛鐵棒錘藥材，按“1.3.4”項(xiàng)下方法制備，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 伏毛鐵棒錘中烏頭堿和3-乙酰烏頭堿回收率實(shí)驗(yàn)

表2 不同產(chǎn)地伏毛鐵棒錘中烏頭堿及3-乙酰烏頭堿含量測(cè)定結(jié)果(n=6)m g/g

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了伏毛鐵棒錘中烏頭堿及3-乙酰烏頭堿兩種生物堿成分的含量，在波長(zhǎng)254、230、280 nm下進(jìn)行掃描，結(jié)果230 nm下兩種成分分離完全，峰形較好，最終選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。由上圖結(jié)果可以看出：伏毛鐵棒錘中烏頭堿和3-乙酰烏頭堿的含量呈地域相關(guān)性，在各單個(gè)生物堿及總生物堿含量中，臨夏最高，天水次之，武威最低。此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得，為以后藥物應(yīng)用提供參考。

［1］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：79.

［2］ 中國(guó)科學(xué)院植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志［M］.北京：科學(xué)出版社，1979：318-319.

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［5］ 張帆，彭樹(shù)林，白冰如，等.伏毛鐵棒錘根中總生物堿的串聯(lián)質(zhì)譜分析［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2006，27(2)：71-73.

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Content Analysis of Aconitine and 3-Acetyla Conitine in TuMao TieBangChui in Different Areas of Gansu Province

MA Xinhuan，GUO Min，QIAO Li，XIAO Zhengguo
Gansu Provincial Hospital of traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China

Objective:To analyze the content difference of aconitine and 3-Acetyla conitine in FuMao TieBangChui(aconitum flavum Hand.-Mazz)in different areas of Gansu Province.Methods:High performance liquid chromatography was used on Gemini-Nx-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)chromatographic column with acetonitrile, 0.2%ammonium bicarbonate solution(55:45)as mobile phase at the detection wavelength of 230 nm with the flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature was 25℃.Results:Linearity range of aconitine was 19.20～57.55 μg/mL while average recovery was 101.30%(RSD=2.34%);Linearity range of 3-Acetyla conitine was 4.8～50 μg/mL while average recovery was 100.67%(RSD=0.77%).Conclusion:The method is fast and handy while the result is accurate and reliable.It can be used in the determination of content and variation analysis on aconitine and 3-Acetyla conitine in FuMao TieBangChui.

FuMao TieBangChui;Gansu;aconitine;3-Acetyla conitine;content analysis

R282.6

A

1004-6852(2016)08-0015-03

2016-03-17

甘肅省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(編號(hào)G ZK-2014-9)。

馬新?lián)Q(1976—)，男，高級(jí)工程師。研究方向：藥物制劑研發(fā)及質(zhì)量控制。