miRNA145介導骨髓間充質干細胞膜微粒減少血管平滑肌細胞遷移

黃若蘭，張忠，陳銘泰，王玲，常曉，喬秋杰

(1.深圳市中醫院 重癥醫學科，廣東 深圳 518033； 2.深圳市中醫院 心血管科，廣東 深圳 518033； 3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 518000)

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·論 著·

miRNA145介導骨髓間充質干細胞膜微粒減少血管平滑肌細胞遷移

黃若蘭1，張忠2，陳銘泰3，王玲1，常曉1，喬秋杰1

(1.深圳市中醫院 重癥醫學科，廣東 深圳 518033； 2.深圳市中醫院 心血管科，廣東 深圳 518033； 3.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 518000)

目的：探討骨髓間充質干細胞(MSC)膜微粒對血管平滑肌細胞(VSMC)增殖遷移的影響及其機制。方法：誘導MSC凋亡釋放膜微粒(MSC- MPs)用于實驗，實驗分為對照組(A組)、膜微粒組(B組)、miRNA145組(C組)、膜微粒加抗miRNA145組(D組)及膜微粒加miRNA145組(E組)5組。細胞遷移實驗評價VSMC的遷移能力，免疫印跡法檢測蛋白表達水平，流式細胞術、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)等比較各組VSMC凋亡水平。以實時定量聚合酶鏈反應檢測miRNA145表達水平。結果：E組VSMC遷移數量最少[(40.4±3.0)個]，D組最多[(69.0±5.6)個]，差異具有統計學意義(P<0.05)；miRNA145的表達水平E組最高，A組與D組最低(P<0.05)；MTT結果提示E組VSMC增殖抑制率及凋亡率最高，D組最低(P<0.05)；半胱氨酸蛋白酶- 3免疫印跡法結果也類似。結論：MSC- MPs可減少VSMC凋亡，抑制VSMC遷移，而miRNA145參與了這一過程。

骨髓間充質干細胞； 膜微粒； 血管平滑肌細胞； 遷移； 凋亡

動脈粥樣硬化性疾病在我國發病率及死亡率都高居首位。由血管功能失衡和損傷修復引起的血管重構，是眾多血管疾病的關鍵病理環節[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)作為維持血管壁結構穩定的主要成分，與多種血管性疾病如動脈粥樣硬化斑塊、冠脈介入術后再狹窄等密切相關[2- 4]。抑制VSMC的增殖和遷移可能會給此類疾病的治療帶來新的希望。

VSMC的功能受到多因素調節，有報道稱微小RNA(miRNA)145抑制VSMC的增殖、凋亡、遷移，與心肌祖細胞存活、損傷修復及缺氧耐受性有關，間接對VSMC起保護作用[5]。miRNAs通過調節VSMC功能影響血管疾病的發生發展已經得到多方驗證[6]。此外，有研究發現，許多干細胞，包括骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM- MSCs)移植具有巨大應用潛力[7]，能在應激或凋亡時通過旁分泌機制產生膜微粒(microparticles，MPs)，實現細胞間的信息傳遞，發揮與來源細胞類似的作用[8- 9]。干細胞通過旁分泌機制釋放的外泌體含有促進受損組織修復的miRNAs，說明干細胞的功能與miRNAs調控存在相關性[10]。本研究采用血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導的VSMC遷移模型，以MSCs- MPs與VSMC共培養，慢病毒轉染干預miRNA145表達或抑制確認其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

1.1.1 細胞 雄性SD大鼠4只，鼠齡4～6周，體重60～80 g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供。大鼠頸椎脫臼處死后，提取股骨和脛骨骨髓腔中的干細胞，詳細方法見參考文獻[11- 12]。

1.1.2 主要試劑 洛斯維培養基(RPMI 1640)購自美國GIBCO公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、Dulbecco’s改良培養基(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(EDTA)等細胞培養常規試劑均購自美國Hyclone公司,AngⅡ購自賽默飛世爾生物化學制品公司，總RNA抽提試劑(Trizol)提取液購自美國Invitrogen公司，細胞遷移實驗小室(transwell)購自美國Corning公司，逆轉錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)購自美國Sigma公司，特殊化學修飾的miRNA145拮抗劑(antago- miRNA145)及其陰性對照(null- miRNA)購自廣州優迪生物科技有限公司。其他試劑為分析純，購自廣州化學制劑總廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 MSC的提取及鑒定 將MSC接種于10%FBS、DMEM培養基，置于飽和濕度、37 ℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養傳代。收集在對數生長期的細胞進行后續干預和實驗。第4代MSC培養至80%融合時，改變培養條件為無血清、低氧(體積分數94%N2、5%CO2和1%O2)，72 h后收集細胞培養的上清液，低速離心5 min，將上清液分裝入超速離心管，提取方法見文獻[9]。

1.2.2 VSMC分離與培養 無菌條件下分離SD大鼠胸主動脈，小心去除內膜和外膜，取中層平滑肌切成1 mm3左右的組織塊，以含20% FBS的DMEM培養液行組織貼壁法原代培養。于37 ℃、體積分數5%CO2條件下靜置培養，3 d后更換培養液。待單層細胞覆蓋培養皿約80%時，取出組織塊傳代。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，含10%FBS、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 U·ml-1青霉素、100 μg·ml-1鏈霉素的DMEM培養液行傳代培養。實驗采用融合度90%左右的第3～5代VSMC。

1.2.3 miRNA145的過表達與敲除實驗 VSMC更換無FBS、無抗生素DMEM進行培養，當細胞密度達到30%～50%時進行轉染，以不含血清培養基的無血清培養基(Opti- MEM)準備miRNA145(或者antago- miRNA145)和脂質體2000(lipo2000)的混合液。100 μl Opti- MEM中加入1 μl lipo2000以及50 nmol·L-1(低濃度組)或100 nmol·L-1(高濃度組)的miRNA145(5′- GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU- 3′)，或者抗miRNA145(5′- AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC- 3′)，然后加入到以400 μl不完全DMEM培養基培養的VSMC中，柔和混勻后孵育24 h，用于后續實驗。

1.2.4 實驗分組及干預 A組為對照組(VSMC+AngⅡ)：Ang誘導的VSMC遷移模型；B組為膜微粒組(MSC- MPs+VSMC+AngⅡ)：MSC- MPs與Ang誘導的血管平滑肌共培養；C組為miRNA145組(過表達miRNA145+VSMC+AngⅡ)：構建過表達miRNA145轉染VSMC，AngⅡ誘導遷移模型；D組為膜微粒加抗miRNA145組(MSC- MPs+抗miRNA145+VSMC+AngⅡ)：MSC膜微粒與抗miRNA145轉染的VSMC共培養，AngⅡ誘導遷移；E組為膜微粒加miRNA145組(MSC- MPs+miRNA145- VSMC+AngⅡ)：MSC膜微粒與miRNA145過表達的VSMC共培養，觀察AngⅡ誘導的VSMC遷移。

1.2.5 細胞遷移實驗 各組VSMC按每孔0.5×105個細胞接種于遷移實驗小室6孔共培養板上層(底部為聚酯透明濾膜)，培養過夜，細胞貼壁后向培養液中加入100 nmol·L-1的AngⅡ作用6 h，建立VSMC遷移模型。各組VSMC按每孔1×105個細胞接種于遷移實驗小室6孔共培養板下層。每個樣品設3個復孔，共培養72 h。取出遷移實驗小室上室，以磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，用棉簽小心擦去微孔膜上層細胞，甲醇室溫固定30 min。0.05%結晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，輕輕撕下基底膜，倒扣至載玻片，風干后用中性樹膠封片，在200倍顯微鏡下選取5個不重疊區域計算遷移的細胞數。

1.2.6 MTT法檢測細胞活性水平 收集VSMC，調整細胞濃度為5×104個·ml-1，每孔加入100 μl，體積分數5%CO2、37 ℃培養過夜，于每孔待測細胞中加入MTT溶液20 μl(5 mg·ml-1)，繼續培養4 h，小心吸去孔內培養液，每孔加二甲基亞砜150 μl，搖床低速振蕩10 min，在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值(A值)。每組設置3個復孔，取平均值為該組A值。

1.2.7 流式細胞術檢測VSMC凋亡率 按照細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ- FITC)操作說明檢測細胞凋亡。把細胞培養液轉移離心管內，PBS洗滌貼壁細胞1次，加入適量胰酶消化細胞，室溫孵育至適當時機，吸除胰酶細胞消化液，將細胞轉移到新離心管內，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS輕重懸細胞并計數。取5～10萬重懸的細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入100 μl 1倍 Annexin Ⅴ緩沖液輕輕重懸細胞，加入5 μl熒光素(AnnexinⅤ- FITC)和 5 μl 碘化丙啶染色液(PI)，輕輕混勻。20～25 ℃避光孵育15 min，隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin Ⅴ- FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.8 免疫印跡法檢測各組半胱氨酸蛋白酶- 3活性 收集上述各組VSMC，向每管沉淀細胞中加入100 μl放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液，混勻后移入1.5 ml離心管。加入苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF，1∶100)，在4 ℃冰箱中靜置30 min后，于4 ℃離心20 min，按照蛋白定量試劑盒使用說明書進行操作。以50 μl上樣，經10%SDS聚丙酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，與半胱氨酸蛋白酶- 3(1∶1 000)常溫搖床振蕩孵育2 h。加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)標記的二抗(博士德公司，1∶2 500稀釋)，常溫孵育1 h，ECL發光液顯影，曝光。以β- 肌動蛋白作為內參，利用Image- Pro Plus 6.0 成像系統分析蛋白質印跡條帶的積分光密度(IOD)值，并計算各組半胱氨酸蛋白酶- 3的IOD值與內參IOD值的比值。以上實驗重復3次。

1.2.9 實時定量聚合酶鏈反應法檢測miRNA145的表達水平 Trizol法提取VSMC總RNA后，在紫外分光光度計儀上測A260/A280值，計算RNA純度和濃度，選擇介于1.8～2.1者為合格樣品，可用于實驗。采用miRNA145特異性逆轉錄引物及逆轉錄試劑盒合成cDNA(TaKaRa)。miRNA145莖環結構逆轉錄引物：5′- GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGGGATTC- 3′；實時定量PCR上下游引物序列如下：正向，5′- GAAGGTCCAGTTTTCCCAGG- 3′；反向，5′- CAGTGCGTGTCGTGGAGT- 3′。定量PCR反應條件如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 34 s(收集熒光信號)，40個循環。融解曲線分析：溫度60～95 ℃，每分鐘讀1次。RNU6B作為實驗的內源性參照。miRNA145的相對表達量采用經典的2-ΔCt來表示(ΔCt=Ct miRNA-CtU6)。每個標本重復實驗3次。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 MSC凋亡時釋放膜微粒的鑒定

低氧低營養條件下培養72 h的BM- MSCs，凋亡率為10%，將細胞培養上清液超速離心后得到沉淀，經過流式細胞儀對這些結構的表型進行檢測，發現其可表達CD29、CD44和CD73，而不表達CD31和CD45，與MSC的表型一致，說明來自MSC，即MSC- MPs。

2.2 VSMC的培養、轉染及鑒定

培養的VSMC呈典型“峰- 谷”樣生長；同一視野下明光觀察病毒轉染后細胞體積無改變，細胞分泌物無增加。

2.3 VSMC遷移情況

遷移實驗小室實驗結果顯示，E組VSMC遷移數量最少[(40.4±3.0)個]，D組[(69.0±5.6)個]與A組[(71.4±2.3)個]之間差異無統計學意義(P>0.05)，而多于B組[(50.8±2.6)個]以及C組[(42.4±3.3)個](P<0.05)。

2.4 VSMC轉染后miRNA145的表達

RT- PCR測定miRNA145的表達水平：A組

2.5 MTT檢測VSMC增殖抑制率

MTT法檢測不同分組對VSMC增殖抑制率的影響，各組結果見圖1。E組增殖抑制率(24.71%±3.20%)最高，D組(4.97%±4.17%)最低(P<0.05)。

圖1 各組間VSMC增殖抑制率差異

Fig 1 Differences of VSMC proliferation rate in each group

2.6 流式細胞術檢測VSMC凋亡率結果

E組凋亡率(13.03%±0.75%)最高，D組(4.12%±0.40%)最低(P<0.05)，與A組(2.87%±0.40%)相比差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.7 VSMC的半胱氨酸蛋白酶- 3表達

與A組相比，E、C、B組的半胱氨酸蛋白酶- 3蛋白表達量差異有統計學意義(P<0.05)，D組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

3 討 論

膜微粒是在細胞損傷、激活或者凋亡時從細胞膜上脫落的直徑<1 μm的膜性囊泡，從其形成及產生方式的不同，膜微粒主要分為兩類：(1)外排體(exosomes)，為均質的膜微粒，直徑40～100 nm，是由細胞的內吞噬而儲存于細胞質多泡體中，并通過胞吐作用釋放至內環境中，其標志物包括CD9、CD63、Alix、flotillin- 1和Tsgl01等；(2)膜微囊(microvesicles)，為不均質的膜微粒，直徑50～1 000 nm，由細胞質膜直接出芽、分裂而產生，其沒有特定的標志物，有報道稱標志物與來源干細胞類似[13]。目前國內外對BM- MSCs的研究認為：許多細胞包括干細胞能在激活或者凋亡時通過旁分泌機制產生MPs[14- 15]，其攜帶表面受體、生物活性分子實現細胞間的信息傳遞，發揮與來源細胞類似的作用。

miRNA發現于真核生物中，是由18～25個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，可通過與特定miRNA的3′非翻譯區(3′- untranslated region，3′UTR)結合，促使miRNA降解或抑制miRNA的翻譯，從而調控基因表達。近年來，對miRNA與干細胞的研究發現，在多種干細胞中均存在各自特異的miRNA表達，對干細胞的生物學活動具有重要的調控作用。以往研究顯示幾種miRNAs家族成員可維持胚胎干細胞的多能性[16- 17]，此外，干細胞通過旁分泌機制釋放的外泌體含有促進受損組織修復的miRNAs，說明干細胞的功能與miRNAs調控存在相關性。Collino等[18]發現，一些miRNAs同時存在于膜微粒及其來源的MSC中，然而有一部分miRNAs卻選擇性地僅存在于膜微粒。而另一部分miRNAs僅存在于MSC。由此可見，間充質干細胞能旁分泌產生膜微粒。同時膜微粒攜帶的RNA為其發揮疾病治療作用的主要組分之一。

本研究通過建立VSMC遷移模型，采用MSC- MPs與VSMC共培養的方式，明確MSC- MPs能抑制AngⅡ誘導的VSMC遷移，減少VSMC遷移率以及增加VSMC凋亡，采用miRNA145干預后，過表達miRNA145加強MSC- MPs的這一作用，而抑制miRNA145減弱MSC- MPs對VSMC的作用，提示MSC- MPs的抑增殖、抑凋亡作用與miRNA145正相關。miRNA145具有抑制血管平滑肌細胞增殖、遷移等作用，而MSC- MPs與血管平滑肌細胞共培養也有抑制血管平滑肌細胞增殖、凋亡的作用[5，19]，說明MSC- MPs對VSMC的作用與miRNA有關，MSC- MPs影響VSMC的增殖、遷移及凋亡有可能通過miRNA145來實現。

圖2 流式細胞術檢測各組凋亡率結果

Fig 2 Apoptosis rate of VSMC in each group detected by flow cytometry

圖3 各組VSMC的半胱氨酸蛋白酶- 3表達

Fig 3 Expression of caspase- 3 in VSMC in each group detected by Western blot

VSMC參與多種疾病的病理過程，VSMC的增殖、遷移和黏附引起血管內膜增生，導致動脈粥樣硬化和再狹窄，對心血管性疾病的發生發展有重要作用[20]。對于終末期心血管病，采用干細胞治療曾被寄予厚望，然而由于損傷組織的缺血缺氧環境，90%以上的MSC移植入體內后72 h內死亡，在存活的干細胞中，通過旁分泌機制產生的膜微粒有可能在修復及再生損傷組織的過程中起關鍵作用[21]。我們的實驗提示這一作用有可能通過miRNA來實現。然而轉染miRNA145后VSMC的遷移減少，凋亡也明顯增加，VSMC適當的凋亡率是維持血管結構及形態的影響因素之一，過度凋亡也會導致血管壁變薄，是動脈粥樣硬化斑塊易損性的干預靶點之一。本實驗中觀察到的VSMC凋亡是否有利于改善動脈粥樣硬化和血管狹窄性疾病，需要動物模型或者其他實驗的進一步驗證。抑制miRNA145后MSC- MPs抑制VSMC遷移及增加凋亡率的作用減少，提示miRNA145有可能起關鍵調控作用。但干細胞膜微粒并非通過單一機制實現細胞調控，仍有待繼續深入研究，以期為心血管疾病的干細胞治療帶來進展及突破。

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Bone marrow mesenchymal stem cell microparticles reduce the migration of vascularsmooth muscle cells through miRNA145

HUANG Ruo- lan1，ZHANG Zhong2，CHEN Ming- tai3，WANG Ling1，CHANG Xiao1，QIAO Qiu- jie1

(1.Department of Intensive Care Unit，Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenzhen 518033，China；2.DepartmentofCardiology，ShenzhenTraditionalChineseMedicineHospital，Shenzhen518033，China；3.GuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510000，China)

Objective: To investigate the impact and mechanism of microparticles derived from bone marrow mesenchymal stem cells (MSC- MPs) on migration and apoptosis of vascular smooth muscle cells(VSMCs).Methods: The bone marrow mesenchymal stem cells were induced to release microparticles(MSC- MPs) through apoptosis for the experiment.Five experimental groups were listed as follows: control group(A group); microparticles group(B group); miRNA145 group(C group); microparticles+antago- miRNA145 group(D group); microparticles+miRNA145 group(E group). Transwell assay was applied to detect the migration of smooth muscle cells， Western blot was used to determine the expression of protein， and flow cytometry and MTT were employed to examine the level of apoptosis in each group.The expression of miRNA145 was determined by real- time polymerase chain reaction(RT- PCR).Results: The number of VSMC migration was significantly lower in E group(40.4±3.0) than that in D group (69.0±5.6)(P<0.05).The MTT and flow cytometry showed that the expression of miRNA145， VSMC proliferation inhibition rate and apoptosis rate were highest in E group and lowest in D group(P<0.05).The result of caspase-3 expression evaluated by Western blot showed the same tendency. Conclusion: MSC- MPs could reduce the apoptosis of VSMC and inhibit the migration of VSMC， while miRNA145 is involved in the process．

bone marrow mesenchymal stem cell； microparticle； vascular smooth muscle cell； migration； apoptosis

2016- 03- 01

2016- 04- 15

國家自然科學基金資助項目(81573922)；廣東省中醫藥局建設中醫藥強省科研項目(20151076)；廣東省科技廳-廣東省中醫藥科學院聯合項目(2014A020221002)

黃若蘭(1981-)，女，廣東饒平人，主治醫師，醫學碩士。E- mail：46743509@qq.com

張忠 E- mail:zzicu@126.com

黃若蘭，張忠，陳銘泰，等.miRNA145介導骨髓間充質干細胞膜微粒減少血管平滑肌細胞遷移[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(4)：475- 481．

R329.2

A

1671- 6264(2016)04- 0475- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.001