自發性高血壓大鼠心肌組織Sirt3表達的增齡性變化

郝廣華，韓振華，靳耀鋒，袁海峰，董新

(西安交通大學醫學院第二附屬醫院 1.心內科，2.病理科，3.腦病科，陜西 西安 710004)

?

·論 著·

自發性高血壓大鼠心肌組織Sirt3表達的增齡性變化

郝廣華1，韓振華1，靳耀鋒2，袁海峰3，董新1

(西安交通大學醫學院第二附屬醫院 1.心內科，2.病理科，3.腦病科，陜西 西安 710004)

目的：探討自發性高血壓(SH)大鼠心肌組織沉默信息調節因子3(Sirt3)表達的增齡性變化。方法：將36只不同周齡Wistar- Kyoto(WKY)大鼠和SH大鼠分為WKY 16、32、64周3個周齡組和SH 16、32、64周3個周齡組，每組6只。采用尾套測壓法測量各組大鼠尾動脈收縮壓，采用Masson染色觀察心肌纖維化，免疫組化染色及免疫組織印跡法檢測左心室心肌組織Sirt3的表達。結果：與同周齡WKY大鼠相比，SH大鼠血壓顯著升高(P<0.05)，心肌組織膠原纖維組織明顯增多，Sirt3蛋白表達水平均顯著下降(均P<0.05)，且呈增齡性下降趨勢。結論：SH大鼠肥厚的心肌組織sirt3表達呈增齡性下降。

高血壓； 心肌肥厚； 心室重構； 沉默信息調節因子3； 大鼠

高血壓心室重構是指在血流動力學負荷以及神經體液因素等的長期作用下心臟的結構及功能發生變化。早期的心室重構是一種對抗心室壁張力增加的適應性代償反應；后期是心力衰竭發生、發展的基礎，與心律失常、猝死以及心力衰竭的發生密切相關，因此是心臟事件的獨立危險因素[1]。

沉默信息調節因子3(silent information regulator protein 3， sirturin 3，Sirt3)屬于Ⅲ類組蛋白脫乙酰基酶類，利用NAD+作為底物，使乙酰化蛋白的賴氨酸去乙酰化，從而參與調節多種生理及病理過程，如壽命、細胞生存、細胞周期、能量代謝、基因組穩定性、脂肪酸合成、糖及胰島素代謝[2]。本實驗以自發性高血壓(spontaneously hypertensive，SH) 大鼠為研究對象，觀察高血壓重塑的左心室心肌組織中Sirt3的表達情況，探討高血壓心室重構過程的新機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物 36只不同周齡(16、32、64周)SH大鼠和Wistar- Kyoto(WKY)大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號:SCXK(滬)2007- 0005]。將動物分為不同周齡(16、32、64周)WKY和SH組，每組6只。動物飼養于室溫23 ℃左右、12 h明暗交替的環境中，允許自由飲食。所有實驗操作已得到西安交通大學醫學院動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑 兔抗Sirt3多克隆抗體以及生物素化山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB顯色劑購自北京中山生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠血壓測量 采用尾套測壓法測量各組大鼠尾動脈收縮壓(SBP)。方法如下：上午9：00點左右，在安靜環境下將清醒狀態大鼠置于37 ℃溫箱內約15 min；調整測壓儀內溫度達37 ℃后，將大鼠放到小籠內，血壓測量儀的壓脈套固定大鼠尾部近心端；調整大鼠鼠尾和換能器接觸的部位，調節儀器的感知，定大鼠血壓域值。待大鼠安靜時用沖氣球加壓，快達到域值時緩慢放氣，速度3～4 mmHg·s-1，將感知鈕調到靈敏位置，此時儀器開始測壓，最后長鳴一聲標志測壓結束，記錄此時的血壓值。測量3次，取平均值作為所測的血壓。

1.2.2 組織標本制備 各組大鼠稱重并測壓，經水合氯醛0.35 mg·kg-1腹腔麻醉后打開胸腔，迅速分離并取出心臟，投入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，洗凈殘血并去除大血管、心房及右心室，左心室稱重后沿垂直于心臟長軸方向分為兩部分：一部分放入4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋；另一部分分為數塊投入液氮中保存，用于組織總蛋白的提取。

1.2.3 Masson染色 4%多聚甲醛固定液固定組織，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，常規脫蠟至水，置Masson復合染液中8 min，0.2%醋酸水溶液清洗2次，再置入1%磷鎢酸中15 min，0.2%醋酸水洗2次，至亮綠染液40 s，0.2%醋酸水溶液清洗2次，滴度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察，膠原纖維呈綠色，心肌纖維呈紅色。

1.2.4 免疫組化染色 組織切片常規脫蠟，0.01 mmol·L-1的檸檬酸鹽抗原修復液(pH 6.0)抗原熱修復，正常山羊血清抗體封閉后加入兔抗大鼠Sirt3多克隆抗體(1∶400)，4 ℃過夜后DAB顯色劑顯色，蘇木素復染、脫水、透明、封片。實驗中用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.2.5 免疫印跡檢測 用裂解液(RIPA)裂解組織后提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白含量。稀釋蛋白樣品為10 μg·μ l-1，加入上樣緩沖液后煮沸10 min后離心，進行8%SDS- PAGE凝膠電泳并電轉至PVDF膜上，封閉緩沖液封閉1 h后滴加兔抗大鼠 Sirt3抗體(稀釋倍數1∶200)，4 ℃孵育過夜，山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化學發光試劑中反應1～3 min；常規方法顯影定影，采用Gel Doc 2000系統拍照及行灰度分析。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠血壓情況

如圖1所示：與同周齡WKY大鼠比較，SH大鼠收縮壓顯著增加(P<0.05)，并且隨周齡增加而呈增加趨勢；WKY組大鼠收縮壓的增齡性變化則不明顯。

2.2 各組大鼠心肌組織膠原含量變化

Masson染色可見SH大鼠心肌細胞肥大，心肌間質及血管旁的膠原纖維組織明顯增多，排列紊亂，且隨周齡增加，SH大鼠的膠原染色明顯增加。WYK大鼠心肌間隙清晰可見，膠原纖維分布稀疏，著色淡，膠原纖維染色在不同WKY周齡組間變化不明顯。見圖2。

2.3 各組大鼠心肌組織Sirt3蛋白表達

免疫組化染色結果表明，Sirt3免疫染色陽性表達主要分布于心肌細胞細胞漿中(圖3)。與同周齡WKY大鼠相比，SH大鼠Sirt3蛋白表達水平顯著降低。且隨周齡增加，SH大鼠Sirt3表達呈明顯下降趨勢。WKY大鼠心肌細胞Sirt3表達亦呈下降趨勢，但不如SH大鼠的變化明顯(圖3)。

a 與同周齡WKY大鼠相比，P<0.05

圖1 各組大鼠SBP

Fig 1 SBP in SH and WKY rats

進一步采用免疫印跡實驗方法觀察各組大鼠左心室心肌組織中Sirt3蛋白的表達水平。如圖4所示，SH大鼠心肌組織中Sirt3蛋白的表達顯著低于同周齡WKY大鼠(P<0.05)。與WKY大鼠相比，SH大鼠Sirt3蛋白表達呈明顯增齡性減低趨勢。

3 討 論

高血壓是最常見的心血管慢性疾病之一，近些年發病率呈明顯增高趨勢。流行病學調查顯示，老年性高血壓患者半數以上以收縮壓增高為主，且易出現心力衰竭、動脈粥樣硬化、腦卒中等嚴重的心腦血管并發癥[3]。高血壓伴發的心室重構可導致心肌細胞壞死、纖維化，心室擴張，最終發生心力衰竭及心律失常[4]。本實驗證實隨著SH大鼠周齡的增加，血壓增高，同時心肌細胞肥大，心肌間質膠原纖維組織明顯增多。

圖2 各組大鼠膠原染色 普通光鏡×200

Fig 2 Left ventricular collagen fiber of rats evaluated by Masson staining(×200)

Sirtuin屬于NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶，參與調節代謝、應激反應以及衰老過程[2]。其中Sirt3是線粒體內存在的關鍵去乙酰化酶。Sirt3在心臟中大量表達，可拮抗心肌肥厚的發生[5]。在本實驗中，隨著SH大鼠血壓的升高以及心肌肥厚的發生，Sirt3的表達顯著下降。提示Sirt3表達下調參與了高血壓心室重構的病理過程。既往研究顯示，Sirt3-/-小鼠更易發生心肌肥厚，而Sirt3過表達阻止了心肌肥厚的發生，其機制可能是Sirt3阻斷了心肌肥厚時Ras的活化，并進一步阻斷MAPK/ERK以及PI3K/Akt通路[6]。心肌肥厚的另一個信號通路是氧化應激以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生。Sirt3可部分阻斷促心肌肥厚因子引起的ROS產生，這一機制主要通過調控Foxo3a及其下游因子，如超氧化物歧化酶SOD、SOD2的線粒體亞型以及過氧化氫酶的表達及活性[6]。此外，也可能存在其他一些機制參與Sirt3的抗心肌肥厚作用,如Sirt3可介導LKB1去乙酰化，隨后激活AMPK，進而阻斷心肌肥厚發生[7]。

圖3 各組大鼠Sirt3蛋白免疫組化染色 普通光鏡×200

Fig 3 Immunohistochemcal staining of Sirt3 in left ventricle of rats(×200 magnification)

a 與同周齡WKY大鼠相比，P<0.05

圖4 免疫印跡法顯示各組大鼠左心室Sirt3蛋白的表達

Fig 4 Sirt3 protein levels in left ventricle of rats analyzed by Western blotting analysis

除外心肌肥厚，Sirt3與衰老性疾病也有關。臨床試驗發現，與青年人相比，以靜態生活方式為主的60歲以上人群，其肌肉組織中Sirt3水平下降約40%，采用耐力鍛煉后，其Sirt3水平上升[8]。本實驗證實，WKY大鼠隨周齡增加，Sirt3亦呈下降趨勢，提示Sirt3表達不足可能參與了機體衰老的發生。線粒體電子傳遞過程中產生的ROS可破壞線粒體外的大分子結構，這一過程參與了許多與衰老有關的病理過程。Sirt3可部分拮抗此作用。Sirt3通過轉錄后水平調節SOD2，繼而參與調控細胞內ROS的水平[9]。此外，Sirt3也可通過直接作用或去乙酰化線粒體內電子轉移鏈的一些組分，如復合物Ⅰ和Ⅲ，直接調控細胞內ROS產生[10- 11]。有實驗證實，Sirt使mPTP開放的調節因子CypD去乙酰化，抑制其活性，減少通過mPTP的促凋亡因子流入細胞以及細胞內ATP的耗竭，從而有望成為治療與衰老有關心臟疾病的新手段[12]。

總之,本實驗證實了SH大鼠心室重構發展過程中存在Sirt3表達下調現象，此結果將有助于揭示高血壓心室重構發生發展的新機制，并為高血壓心室重構的干預提供可能的靶點。

[1] BURSZTYN M.Left ventricular hypertrophy in hypertension and nocturnal blood pressure[J].J Clin Hypertens(Greenwich),2015,17(12):914- 915．

[2] WATROBA M,SZUKIEWICZ D.The role of sirtuins in aging and age- related diseases[J].Adv Med Sci,2015,61(1):52- 62．

[3] LAWLER P R,HIREMATH P,CHENG S.Cardiac target organ damage in hypertension:insights from epidemiology[J].Curr Hypertens Rep,2014,16(7):446．

[4] VELASCO M,ISRAILI Z.Hypertension:from epidemiology to therapeutics[J].J Hypertens,2012,2012:908431．

[5] SACK M N.The role of SIRT3 in mitochondrial homeostasis and cardiac adaptation to hypertrophy and aging[J].J Mol Cell Cardiol,2012,52(3):520- 525．

[6] SUNDARESAN N R,GUPTA M,KIM G,et al.Sirt3 blocks the cardiac hypertrophic response by augmenting Foxo3a- dependent antioxidant defense mechanisms in mice[J].J Clin Invest,

2009,119(9):2758- 2771．

[7] PILLAI V B,SUNDARESAN N R,KIM G,et al.Exogenous NAD blocks cardiac hypertrophic response via activation of the SIRT3- LKB1- AMP- activated kinase pathway[J].J Biol Chem,2010,285(5):3133- 3144．

[8] LANZA I R,SHORT D K,SHORT K R,et al.Endurance exercise as a countermeasure for aging[J].Diabetes,2008,57(11):2933- 2942．

[9] ZENG L,YANG Y,HU Y,et al.Age- related decrease in the mitochondrial sirtuin deacetylase Sirt3 expression associated with ROS accumulation in the auditory cortex of the mimetic aging rat model[J].PLoS One,2014,9(2):e88019．

[10] KENDRICK A A,CHOUDHURY M,RAHMAN S M,et al.Fatty liver is associated with reduced SIRT3 activity and mitochondrial protein hyperacetylation[J].Biochem J,2011,433(3):505- 514．

[11] JING E,EMANUELLI B,HIRSCHEY M D,et al.Sirtuin- 3 (Sirt3) regulates skeletal muscle metabolism and insulin signaling via altered mitochondrial oxidation and reactive oxygen species production[J].Pro Natl Acad Sci U S A,2011,108(35):14608- 14613．

[12] HAFNER A V,DAI J,GOMES A P,et al.Regulation of the mPTP by SIRT3- mediated deacetylation of CypD at lysine 166 suppresses age- related cardiac hypertrophy[J].Aging,2010,2(12):914- 923．

Expression changes of Sirt3 with age in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats

HAO Guang- hua1，HAN Zhen- hua1，JIN Yao- feng2，YUAN Hai- feng3，DONG Xin1

(1.Department of Cardiology，2.Department of Pathology，3.Department of Encephalopathy，the SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine，Xi’an710004，China)

Objective： To investigate the expression changes of Sirt3 with age in left ventricle of spontaneously hypertensive(SH) rats. Methods: Thirty- six Wistar- Kyoto(WKY) and SH rats of different age were divided into WKY (16，32，64 weeks) and SHR(16， 32， 64 weeks)groups with 6 rats in each group. Systolic blood pressure of rats was measured by tail cuff method and left ventricular fibrosis was detected by Masson staining. The level of Sirt3 expression was analyzed by immunohistochemistry staining and Western blotting. Results: In comparison with WKY rats of the same age， the systolic blood pressure(P<0.05) and left ventricular fibrosis of rats in SH rats were higher. The expression of Sirt3 protein was lower in the SH rat group and was decreased with age(P<0.05).Conclusion: Sirt3 expression in the hypertrophic left ventricle of SH rats is decreased with age.

hypertension； hypertrophy； cardiac remodeling； silent information regulator protein 3; rats

2016- 03- 28

2016- 04- 13

國家自然科學基金資助項目(30900693)；陜西省社會發展科技攻關項目(2015SF021)

郝廣華(1978-)，女，陜西寶雞人，主治醫師，醫學博士。E- mail:guanghua- h@163.com

韓振華 E- mail：drhanzhenhua029@163.com

郝廣華，韓振華，靳耀鋒，等.自發性高血壓大鼠心肌組織Sirt3表達的增齡性變化[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(4)：487- 491．

R- 33; R544.1

A

1671- 6264(2016)04- 0487- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.003