二型固有淋巴細胞相關因子在食管癌患者外周血中的表達情況分析

紀勇，胡斌，朱乾坤，朱幸楓，徐震壯，吳小波

(南京醫科大學 附屬無錫市人民醫院，江蘇 無錫 214023)

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·論 著·

二型固有淋巴細胞相關因子在食管癌患者外周血中的表達情況分析

紀勇，胡斌，朱乾坤，朱幸楓，徐震壯，吳小波

(南京醫科大學 附屬無錫市人民醫院，江蘇 無錫 214023)

目的：探討二型固有淋巴細胞(ILC2s)在食管癌發生發展中的作用。方法：熒光定量PCR技術檢測我院手術治療的食管癌患者及健康對照者外周血單個核細胞(PBMC)中GATA3、RORα、T1/ST2及IL- 33 mRNA的表達量；ELISA技術檢測血漿中IL- 33含量。結果：食管癌患者PBMC中ILC2s相關分子轉錄因子GATA3和RORα、表面膜受體T1/ST2及活化分子IL- 33的mRNA水平都比健康人高，并且患者血漿IL- 33含量明顯升高(P<0.05)。結論：食管癌患者ILC2s效應增強，可能通過效應分子的分泌及介導Th2細胞的極化而在食管癌的發生發展中發揮重要作用。

二型固有淋巴細胞； Th2細胞； 食管癌

食管癌是目前全球發病率較高的惡性腫瘤，并且預后差、死亡率高。高復發率和易轉移是食管癌預后不良的主要原因之一。隨著腫瘤免疫學研究的深入，人們發現腫瘤患者體內存在多種免疫抑制性細胞，這些細胞及其分泌的相關因子抑制機體的抗腫瘤免疫應答，構成一個免疫抑制性的環境，利于腫瘤細胞逃避機體免疫應答，是阻礙腫瘤治療成功的一大障礙。食管癌患者Th1與Th2比例失衡是腫瘤逃避機體抗腫瘤免疫應答的主要原因之一[1]。二型固有淋巴細胞(group 2 innate lymphoid cells， ILC2s)在Th2細胞介導的免疫應答中扮演重要作用[2]。本研究通過檢測ILC2s特異性轉錄因子、相關細胞因子及膜表面細胞因子受體，分析ILC2s在食管癌患者外周血中的情況，探討ILC2s在食管癌發生發展中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集我院2012年11月至2014年2月新確診的食管癌患者42例，其中男30例，女12例，年齡34～68歲，平均57.4歲。所有患者的臨床和實驗室檢查均符合食管癌的診斷標準，并且外周血液標本收集時患者均未經臨床處理。30名健康體檢者標本作為對照，其中男20例，女10例，年齡35～74歲，平均58.4歲，既往有過敏病史或合并慢性支氣管炎、高血壓、糖尿病患者予以排除。兩組研究對象性別、年齡、病情等方面差異無統計學意義(P>0.05)。研究方案經我院倫理委員會批準，所有受檢者都簽訂知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集 收集外周血標本后分離出血漿并置于-80 ℃保存，Ficoll分離液(上海博升生物科技有限公司)分離出外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并加入1 ml Trizol(Invitrogen公司)，-80 ℃保存，用于RNA的提取。

1.2.2 RNA提取及定量PCR 用異硫氰酸胍/苯酚法人總RNA提取試劑盒(上海索萊寶生物科技有限公司)提取PBMC總RNA；取500 ng RNA，使用Prime Script RT Reagent Kit Perfect Real Time試劑盒 (TaKaRa公司)進行逆轉錄；以GenBank為基礎，使用Premier 5.0軟件設計引物(表1)，由上海Invitrogen公司合成；使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa公司)進行熒光定量PCR。各目的基因相對β- 肌動蛋白表達的倍數變化用基于閾值循環數(Ct)的方式計算。所有樣本分別獨立檢測3次。

表1 定量PCR各引物序列

Tab 1 Quantitative PCR sequences for each primers

基 因引 物GATA3上游：5′?TTGTGGTGGTCTGACAGTTC?3′下游：5′?AGTACAGCTCCGGACTCTTC?3′RORα上游：5′?CTGACGAGGACAGGAGTAGG?3′下游：5′?GTGCGCAGACAGAGCTATTC?3′T1/ST2上游：5′?AGATGAGTCACTGGCATACG?3′下游：5′?GAGAGGCTGGCTGTTGTATT?3′IL?33上游：5′?TGACGGTGTTGATGGTAAGATG?3′下游：5′?ACAGAGTGTTCCTTGTTGTTGG?3′β?肌動蛋白上游：5′?TGGCACCCAGCACAATGAA?3′下游：5′?CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA?3′

1.2.3 ELISA方法檢測血漿細胞因子 血漿IL- 33水平用ELISA試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)檢測，各樣品均重復檢測3次，求平均濃度，用標準曲線法計算血漿含量。

1.3 統計學處理

使用Graph Pad Prism 5.0軟件進行統計學分析，組間比較采用非配對t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 食管癌患者PBMC中RORα和GATA3表達升高

RORα和GATA3是ILC2s形成和發揮功能的重要轉錄因子，定量PCR分析食管癌患者及健康對照者PBMC中RORα和GATA3的表達情況，結果顯示，食管癌患者PBMC中RORα和GATA3表達水平較健康對照者明顯升高(圖1)。

a與對照比較，P<0.05

圖1 PBMC中RORα mRNA和GATA3 mRNA表達水平的比較

Fig 1 The expression level of RORα mRNA and GATA3 mRNA in PBMC

2.2 食管癌患者PBMC中ILC2s表面分子T1/ST2 mRNA的表達升高

T1/ST2是ILC2s表面相對特異性的受體分子，比較食管癌患者和健康對照者T1/ST2的PBMC中T1/ST2 mRNA的表達情況，結果顯示，食管癌患者T1/ST2 mRNA的表達明顯升高(圖2)。

2.3 食管癌患者PBMC中IL- 33 mRNA水平增高并且血漿中IL- 33含量增加

IL- 33能夠誘導ILCs和Th2細胞的極化，通過定量PCR檢測PBMC中IL- 33 mRNA水平，用ELISA方法檢測血漿IL- 33含量，結果顯示，食管癌患者PBMC中IL- 33 mRNA水平明顯增高，血漿中IL- 33含量明顯增多(圖3)。

a 與對照比較，P<0.05

圖2 TT1/ST2的變化

Fig 2 The expression level change of TT1/ST2

a 與對照比較，P<0.05； b 與對照比較,P<0.05

圖3 IL- 33在PBMC和血漿中表達水平的比較

Fig 3 The level of IL- 33 mRNA in PBMC and the level of IL- 33 in plasma

3 討 論

ILC2s是最近才被認識的一群細胞，又稱為nuocytes、固有輔助細胞或者天然輔助細胞，可以被IL- 25和(或)IL- 33活化。ILC2s高表達T1/ST2、IL- 17BR、IL- 7Rα、ICOS和CD45。ILC2s分泌的IL- 13和IL- 5能誘導機體早期的Th2型免疫應答，在機體抗寄生蟲感染及氣道炎癥反應方面具有重要作用[3- 4]。而且文獻報道顯示ILC2s能抑制過敏性哮喘相關的氣道高反應性[5]。除此之外，ILC2s對急性流感病毒感染所致的氣道組織損傷具有修復作用[6]。已經證實CD4+Th1細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)是機體發揮抗腫瘤免疫力的主要細胞群，然而免疫反應偏離Th2型應答時，Th1細胞反應將受到抑制[7]。最近研究發現，該ILC2s是肺部精氨酸酶1(Arg1)的重要來源之一，并且IL- 33通過增加ILC2s和巨噬細胞的數量從而活化Arg1[8]。腫瘤發生時，Arg1通過多種效應抑制T細胞的作用，使腫瘤逃避機體的抗腫瘤免疫應答。

本研究中我們分析了食管癌患者PBMC中ILC2s相關因子的表達水平，結果顯示，食管癌患者PBMC中轉錄因子RORα和GATA3、膜表面受體T1/ST2及二型細胞因子IL- 33的mRNA水平都增高，并且血漿中IL- 33水平也明顯增高。這些說明食管癌發生時，ILC2s效應增強，并且可能通過介導機體偏向Th2免疫應答的方式促進腫瘤的免疫逃逸，從而利于食管癌發生發展。但ILC2s介導Th2型應答的詳細機制還有待進一步研究。

總之，通過特異性轉錄因子、受體和相關的細胞因子的檢測，我們發現，食管癌患者ILC2s增多，這可能參與Th1/Th2細胞的不平衡，從而抑制機體的抗腫瘤免疫應答，但ILC2s在食管癌中的作用仍有待進一步研究。

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Analysis of the expression of ILC2s associated moleculars in peripheral blood mononuclear cells of esophageal cancer patients

JI Yong，HU Bin，ZHU Qian- kun，ZHU Xin- feng，XU Zhen- zhuang，WU Xiao- bo

(Wuxi People，s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Wuxi 214023，China)

Objective: To investigate the role of group 2 innate lymphoid cells(ILC2s) in the genesis and development of esophageal cancer. Methods: Quantitative PCR was used to examine the expression of GATA3，RORα，T1/ST2 and IL- 33 mRNA of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)， and ELISA was used to detect the level of IL- 33 in the plasma of esophageal cancer patients and healthy controls. Results: The expression of GATA3，RORα，T1/ST2 and IL- 33 mRNA of peripheral blood mononuclear cells(PBMC) and the level of IL- 33 in the plasma of esophageal cancer patients were higher than those of healthy controls(P<0.05). Conclusion: The effects associated with ILC2s of esophageal cancer patients are increased， and ILC2s may play an important role in the genesis and development of esophageal cancer by the secretion of effector moleculars and mediating the polarization of Th2 cells．

group 2 innate lymphoid cells； T helper 2 cells； esophageal cancer

2016- 03- 30

2016- 04- 16

國家自然科學基金資助項目(H81402004)；無錫市科技局指導性項目(CSZ00N1205)

紀勇(1981-)，男，江蘇東海人，副主任醫師，醫學博士。E- mail:1545113644@qq.com

吳小波 E- mail:wuxb@wuxiph.com

紀勇，胡斌，朱乾坤，等.二型固有淋巴細胞相關因子在食管癌患者外周血中的表達情況分析[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(4)：502- 505．

R735.1

A

1671- 6264(2016)04- 0502- 04

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.006