Slug與食管癌侵襲轉移間的關系及其調控機制研究

魏娉，路三軍，嚴金海，郭俊萍，姜琳娜

(1.邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002； 2.磁縣人民醫院，河北 邯鄲 056500)

?

·論 著·

Slug與食管癌侵襲轉移間的關系及其調控機制研究

魏娉1，路三軍1，嚴金海2，郭俊萍1，姜琳娜1

(1.邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002； 2.磁縣人民醫院，河北 邯鄲 056500)

目的:研究Slug與食管癌侵襲轉移間的關系及其調控機制。方法:分別將構建好的pcDNA 3.1- Slug和miR- 140通過Lip 2000轉染到Eca- 109中，以pcDNA 3.1和Lip 2000空轉作為對照組，顯微鏡下觀察轉染前后細胞的形態變化，檢測細胞中E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達情況變化，另外使用穿透小室法檢測細胞的侵襲能力在轉染前后的變化情況。結果:轉染pcDNA 3.1- Slug和miR- 140到Eca- 109中后細胞變得細長。轉染pcDNA 3.1- Slug的Eca- 109中E- 鈣黏素表達下調，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達上調，細胞穿透基質膠的數量明顯增多。轉染miR- 140的Eca- 109中E- 鈣黏素表達上調，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達下調，細胞穿透基質膠的數量明顯減少。在食管癌細胞中miR- 140和Slug的表達呈負相關(r=-0.96)。結論:轉錄因子Slug能夠提高食管癌上皮細胞的間質轉化能力和侵襲能力，而miR- 140是通過調控Slug來調節食管癌細胞侵襲性的。

Slug； 微小核糖核酸- 140； 食管癌； 侵襲能力； 上皮細胞- 間充質轉化

在上皮細胞- 間充質轉化(EMT)發生過程中，E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白等多種信號分子參與其中，在該過程中發揮著重要作用[1- 4]。Slug基因是一種鋅指轉錄因子，研究顯示，其在EMT的發生和發展過程中具有非常重要的作用，腫瘤的血管生成和轉移與Slug基因的表達密切相關[5- 7]。另外研究顯示，miRNA在EMT中也具有非常重要的作用，例如miR- 200和miR- 205均已被證明能夠一直EMT，從而降低癌細胞的侵襲能力[8- 9]。然而miR- 140可能與Slug在食管癌侵襲和轉移的過程中具有某種相互作用。本研究探討了二者在食管癌侵襲和轉移過程中的關聯，以期為后期食管癌轉移的控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

Eca- 109人食管癌細胞株購自上海天呈醫流科技股份有限公司,Slug cDNA的全長pcDNA 3.1載體由作者所在實驗室研究人員構建完成,氯仿購自上海一基生物試劑有限公司,PCR試劑盒購自上海生工生物技術有限公司,Liposomes轉染試劑盒購自Invitrogen公司,RPMI 1640購自Hyclone公司,相關引物由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 pc- DNA3.1- Slug載體構建 設計Slug的引物序列為上游：5′- GCTCCTTCCTGGTCAAGAAACAT- 3′，下游：5′- CCGAGGTGAGGATCTCTGGTT- 3′。使用氯仿抽取Eca- 109細胞總RNA后反轉成cDNA，再使用Slug的引物擴增Slug DNA片段，然后構建重組pcDNA 3.1- Slug質粒并測序鑒定。測序鑒定無誤后使用Lip 2000將構建好的重組pcDNA 3.1- Slug質粒和miR- 140分別轉染至Eca- 109中，標記為pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109組和miR- 140/Eca- 109組，另以Lip 2000轉染Eca- 109細胞和pcDNA 3.1質粒轉染組作為對照組。

1.2.2 細胞形態學觀察 轉染48 h后在顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化。

1.2.3 免疫化學檢測細胞中E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達 將轉染的細胞培養48 h后漿細胞接種在涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，細胞貼壁后取出撥片，用之前已預冷的丙酮固定，PBS沖洗，加入對應的1∶1 000稀釋過的一抗，30 min后PBS沖洗5 min，重復3次，然后加入二抗，37 ℃ 30 min后PBS沖洗5 min，重復3次，再加入三抗，30 min后PBS沖洗5 min，重復3次，然后DBA顯色。計算E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白呈陽性的細胞數。

1.2.4 實時PCR檢測miR- 140和Slug的表達情況 引物設計：miR- 140莖環引物序列為：正義鏈5′- GGCAGAGAGTCCTAGCAGTC- 3′，反義鏈5′- AGTCAGATGACAGCCCCACA- 3′，Slug莖環引物序列為正義鏈5′- GCATTTCTTCACTCCGAAGC- 3′，反義鏈5′- TGAATTCCATGCTCTTGCAG- 3′。

表達量的計算公式為：相對表達量(R)=2-△△ct=

2-[(ct樣品- ct內參)- (ct空白- ct內參空白)]。

1.2.5 穿透小室法檢測細胞體外侵襲能力 將穿透小室置于24孔板內，微孔膜嵌套上室鋪一層基質膠，嵌套下室加入500μl事先配好的RPMI 1640(含有10%胎牛血清)，然后在嵌套上室中加入200 μl細胞懸液，每小組設置3復孔，培養48 h后取出小室，去基質膠后使用4%的多聚甲醛固定，HE染色后顯微鏡下觀察細胞并計數，穿膜的細胞數表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 轉染前后細胞的形態變化

轉染培養24 h后在光鏡下觀察細胞的形態學變化可知，pcDNA 3.1- Slug/ Eca- 109及miR- 140/Eca- 109組細胞與Lip 2000/Eca- 109組細胞及pcDNA 3.1/Eca- 109組細胞在形態學上的區別主要是pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109及miR- 140/Eca- 109轉染的細胞更細長，見圖1A、B、C。

A.未轉染； B.pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109轉染，細胞變得更細長； C.miR- 140/Eca- 109轉染

圖1 轉染培養24 h后光鏡下觀察圖 ×400

2.2 體外驗證miR- 140對EMT轉化的調控作用

免疫化學染色顯示，E- 鈣黏素主要位于Eca- 109細胞的胞漿和胞膜中，N- 鈣黏蛋白主要位于包膜中，波形蛋白主要位于胞漿中，呈顆粒狀。蛋白質印跡法檢驗NC(non- specific control)、miR- 140模擬物、inhibitor加NC以及inhibitor轉染Eca- 109細胞后E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白、波形蛋白的表達情況，結果顯示，miR- 140表達上調，相應的E- 鈣黏素表達量上升，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達量下降。反之，在miR- 140表達受到抑制時，E- 鈣黏素表達量下降，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達量上升。據此可以推測miR- 140的表達可能調控E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達。見圖2、3。

GAPDH為甘油三磷酸脫氫酶

圖2 miR- 140表達對EMT標志物表達影響的蛋白質印跡法檢測結果

圖3 miR- 140表達對EMT標志物表達影響的積分光密度(IOD)檢測結果

2.3 miR- 140對Slug的調控作用

為檢測miR- 140對Slug的調控作用，使用免疫印跡法檢測miR- 140的表達量變化與Slug表達量之間的關系。結果顯示，miR- 140的表達與Slug的表達呈負相關(r=-0.96)，該結果預示著miR- 140很有可能是通過作用于Slug基因來發揮調控作用的。見圖4～7。

2.4 miR- 140通過Slug發揮作用的驗證

為驗證miR- 140在Eca- 109細胞中對Slug的調控作用，通過RNA干擾的方法檢測miR- 140的表達與Slug表達的關系，結果顯示，Slug的表達水平在miR- 140抑制劑和siRNA/對照組共轉染細胞中均明顯降低。穿透小室侵襲實驗結果顯示，與對照組相比，miR-140抑制劑轉染沉默Slug的細胞后細胞的浸潤力發生了一定程度的逆轉。由此說明，miR- 140可能需要通過Slug發揮作用。見圖8、9。

圖4 定量實時檢測食管癌組織和對應癌旁組織中Slug相對于GAPDH的表達水平

圖5 實時檢測NC組、miR- 140模擬物、抑制劑加NC和miR- 140抑制劑的Eca- 109細胞中Slug的mRNA表達水平

圖6 蛋白質印跡法檢測NC組、miR- 140模擬物、抑制劑加NC和miR- 140抑制劑的Eca- 109細胞中的Slug表達水平(以GAPDH作為對照)

圖7 miR- 140與Slug的mRNA在腫瘤樣本中表達量之間的關系

3 討 論

近年來食管癌在全球范圍內的致死率已經上升至第6位[10- 11]。臨床上主要采用手術并輔以放療和化療的治療方法，然而腫瘤易轉移而使患者的生存率始終保持在很低的水平[12]。闡明食管癌發生的機制對其預防和治療具有非常重要的意義。癌細胞的侵襲性主要是通過極性和黏附性來體現的，一旦有極性和黏附性的上皮細胞被轉化成具有侵襲性和移動性的間充質細胞后癌細胞便變成了具有侵襲性的細胞[13]。EMT因在上皮細胞惡性腫瘤的發生和發展過程中具有重要作用而成為研究的熱點之一[14]。研究顯示，九成以上的惡性腫瘤均發生EMT而成為具有浸潤性的細胞而發生轉移[15]。Slug是轉錄因子Snail家族的一員，主要編碼一種鋅指蛋白，在胚胎發育過程中發揮著重要的作用，也是激活EMT過程中非常重要的轉錄因子之一[13]。其在EMT發生過程中主要有E- 鈣黏素、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白等標志物表達量的改變，主要是在具有浸潤性的細胞中E- 鈣黏素表達下調、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達上調。研究表明，miRNA在EMT的發生過程中也發揮著調控作用，通過RNA干擾機制來沉默腫瘤基因[16]。有研究顯示，miR- 140在EC細胞中的表達量下降，Slug的表達量在EC細胞中卻有所增加，但是其機制并未闡明。本研究旨在闡述Slug與食管癌侵襲轉移間的關系并闡明其調控機制。

本研究結果顯示，將pcDNA 3.1- Slug質粒和miR- 140轉入Eca- 109細胞中構建穩轉株，同時以miR- 140的模擬物、miR- 140抑制劑等來調控miR- 140的表達量，以此來探討miR- 140的表達量和Slug表達量及其他標志物表達量之間的關系。研究結果顯示，沉默miR- 140導致E- 鈣黏素表達量的減少、N- 鈣黏蛋白和波形蛋白的表達量上升，能穿過基底膜的細胞數量明顯增加，顯示具有侵襲性和轉移性的細胞數量明顯增多。而在miR- 140高表達的樣本中，由于miR- 140表達量的上升而導致E- 鈣黏素表達量上升，能穿過基底膜的細胞數量明顯減少，說明具有侵襲性和轉移性的細胞數量明顯減少，N- 鈣黏蛋白和波形蛋白表達量的下降，且miR- 140表達量和Slug的表達量呈負相關，其相關系數為-0.96。推測原因miR- 140對Slug的調控可能是與其3′- UTR結合而發揮作用，具體機制還有待進一步研究。

aP<0.05

A. 在Eca- 109細胞中Slug的相對表達量，可以看出抑制劑+siRNA/對照組和抑制制劑組的Slug相對表達量明顯高于抑制劑+siRNA/Slug組；B.不同組別中侵襲細胞數目，可以看出抑制劑+siRNA/對照組和抑制劑組侵襲細胞百分含量明顯高于抑制劑+siRNA/Slug組

圖8 Slug在miR- 140抑制劑和siRNA/對照組共轉染以及Slug沉默的細胞中的表達

圖9 穿透小室實驗檢測結果 ×100

綜上所述，在食管癌細胞中Slug高表達從而能誘導EMT的發生，增強癌細胞的侵襲和轉移能力，而miR- 140的過表達能夠增強Eca- 109細胞的侵襲和轉移能力，且miR- 140是通過靶向調控Slug的表達來影響食管癌的侵襲力和轉移的。

[1] 鄧超，王磊，丁浩然.E- 鈣黏素在膠質瘤增殖與侵襲中的作用[J].腫瘤防治研究，2011，18(8):957- 959．

[2] 趙文文，丁愛萍，周泉，等.N- 鈣黏蛋白在胃癌組織中的表達[J].青島醫藥衛生，2013，21(3):164- 168．

[3] 李祖茂.人波形蛋白中間絲的結構和功能及其與腫瘤的關系[J].醫學綜述，2009，24(17):2593- 2595．

[4] 馮迪，耿敬姝，于曉宇，等.Slug、E- cadherin、Vimentin及β- catenin在基底細胞樣乳腺癌中的表達[J].中國腫瘤，2013，23(9):757- 761．

[5] THAO A I，KARTHIKEYAN K，YEON W S，et al.Toxicity of nano molybdenum trioxide toward invasive breast cancer cells[J].Acs Appl Mater Inter，2014，6(4):2980- 2986．

[6] 錢江，陳旺盛，文坤明，等.Slug和E- cadherin在結直腸癌組織中的表達及臨床意義[J].中國老年學雜志，2012，24(13):2683- 2685．

[7] PARAS J，MUSHAL N，ROBERT G，et al.Over expression of Slug is associated with malignant progression of esophageal adenocarcinoma [J].World J Gastroenterol，2008，24(7):1044- 1052．

[8] 陶光利，張璟，卓文磊，等.RNA干擾抑制Slug表達在TGF- β1誘導的腎小管細胞間質轉分化中的抑制作用[J].免疫學雜志，2010，19(10):872- 875，882．

[9] TRAN M N，CHOI W，WSZOLEK M F，et al.The p63 protein isoform ΔNp63α inhibits epithelial- mesenchymal transition in human bladder cancer cells:Role of miR- 205[J].JBC，2013，288(5):3275- 3288．

[10] 王文憑，陳龍奇.食管癌外科治療的現狀與展望[J].中國胸心血管外科臨床雜志，2011，9(1):58- 65．

[11] 朱靜，陳小飛.食管癌分子靶向治療研究進展[J].現代醫學，2011，39(5):623- 626.

[12] 赫捷，邵康.中國食管癌流行病學現狀、診療現狀及未來對策[J].中國癌癥雜志，2011，14(7):501- 504．

[13] 徐蕾，李旭，陳葳.轉錄因子Snail、Slug在人宮頸癌上皮- 間質轉化中的作用[J].西安交通大學學報：醫學版，2012，9(6):778- 782．

[14] 洪倫，沈守榮.上皮- 間質轉化及相關microRNA分子與腫瘤的惡性行為的研究進展[J].中國癌癥雜志，2011，21(9):725- 730．

[15] ADRIAN J M，GERALDINE G.Epithelial transition zones:merging microenvironments，niches，and cellular transformation[J].EJD，2011，21(2 Suppl):21- 28.

[16] 陶光利.Snail、Slug基因RNA干擾對腎小管上皮細胞轉分化的作用[D].重慶：第三軍醫大學，2011．

Relationship between Slug and the invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulation mechanism

WEI Ping1，LU San- jun1，YAN Jin- hai2，GUO Jun- ping1，JIANG Lin- na1

(1.The First Hospital of Handan City，Handan 056002，China； 2.The People’s HospitalofCixian，Handan056500，China)

Objective： To study the association of Slug with invasion and metastasis of esophageal carcinoma and its regulating mechanism. Methods: pcDNA 3.1- Slug recombinant plasmid was constructed and transfected into esophageal carcinoma cell lines of Eca- 109，with pcDNA 3.1 and Lip 2000 mock transfection served as control group. The morphological changes of cells were observed under the microscope. The expressions of E- cadherin， N- cadherin and vimentin were determined， and invasion ability of the cells before and after transfection was detected by Transwell chamber method. Results:The cells of miR- 140/Eca- 109 and pcDNA 3.1- Slug/Eca- 109 became elongated. The expression of E- cadherin was down- regulated，and N- cadherin and waveform protein was increased in the Eca- 109 cells when transfected with pcDNA 3.1- Slug.The expression of E- cadherin was up- regulated， and N- cadherin and waveform protein was decreased in the Eca- 109 cells when transfected with miR- 140.The number of cells through the Matrigel was significantly reduced. The expression of miR- 140 and Slug in esophageal carcinoma cells was negatively correlated(r=-0.96). Conclusion: The Slug transcription factor can improve the ability of mesenchymal transition and invasion of esophageal epithelial cells， and miR- 140 may regulate the cell invasion of Eca- 109 via controlling Slug expression．

Slug; miR- 140; esophageal cancer; invasion ability; epithelial- mesenchymal transition

2016- 02- 01

2016- 03- 20

魏娉(1974-)，女，河北邯鄲人，副主任醫師，醫學碩士。E- mail:2049167585@qq.com

魏娉，路三軍，嚴金海，等.Slug與食管癌侵襲轉移間的關系及其調控機制研究[J].東南大學學報：醫學版，2016，35(4)：569- 574．

R735.1

A

1671- 6264(2016)04- 0569- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.04.022