生防解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)最新研究進展

李紅曉, 張殿朋, 盧彩鴿, 趙洪新

(1.沈陽師范大學 化學與生命科學學院，遼寧 沈陽 100034；2.北京市農林科學院 植物保護環境保護研究所，北京 100097；3.浙江理工大學 生命科學學院 浙江省植物次生代謝重點實驗室，浙江 杭州 310018)

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生防解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)最新研究進展

李紅曉1,2, 張殿朋2, 盧彩鴿2, 趙洪新1,3*

(1.沈陽師范大學 化學與生命科學學院，遼寧 沈陽 100034；2.北京市農林科學院 植物保護環境保護研究所，北京 100097；3.浙江理工大學 生命科學學院 浙江省植物次生代謝重點實驗室，浙江 杭州 310018)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是與枯草芽胞桿菌相似，可產芽胞、革蘭陽性(G+)、具有生防活性的益生細菌。其代謝過程中產生的抗菌物質種類多、抗菌譜廣，其抗菌制劑或抗菌提取物具有無毒、無害、無殘留、抑菌時效長等優點，可廣泛應用于果蔬保鮮、果蔬生長期及采后微生物病害的生物防治，是極具開發價值的生防菌。本文從抗菌機理、抗性基因組成、基因工程菌構建、抗性產品開發及對微生物病害防治等幾個方面，對解淀粉芽胞桿菌的研究及應用現狀進行了歸納和總結，為其在農業生物工程中的規模化安全應用提供參考。

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)；抑菌物質；生防效果；抗性基因

農作物微生物病害一直是困擾農業生產的大問題，是造成作物減產、影響經濟效益的主要原因之一。長期以來，化學農藥的使用是防治作物微生物病害的主要手段，但會導致農藥殘留，一方面給生態環境帶來巨大影響，尤其微生態系統中的病原微生物產生抗藥性，導致農藥噴灑的濃度越來越高、用量越來越大，農藥殘留問題越來越嚴重。另一方面，殘留農藥通過食物鏈層級傳遞，給人類健康帶來潛在的危險，已引起人們的高度關注[1]。因此，尋找綠色、環保、高效、安全的微生物病害防治手段，是農業生物工程領域的研究熱點。 拮抗作用是指一類微生物產生的可以抑制或殺死它類微生物的作用，是微生物界普遍存在的現象，這為利用拮抗微生物來防治作物微生物病害，提供了極大的可能。經過幾十年的努力，已有很多生防菌制劑面市，在生物防治中起到了積極作用。盡管如此，生防菌劑在所有植物病害防治中所占據的市場份額，仍然不足三分之一[2]，因此，生防菌劑具有巨大的開發空間，應用前景十分廣闊。目前，研究和開發利用較多的生防細菌有芽胞桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、土壤放射桿菌(Agrobacterium)等。其中芽胞桿菌因其產生的抗菌活性物質豐富、種類較多、抑菌譜廣、芽胞抗逆性強、活菌率高、抑制作用時間長等優點，且生物防治過程中與化學試劑有良好的相容性而備受關注[3]。除抗菌物質如降解酶、抗生素、氰化物等的直接作用外，絕大多數拮抗芽胞桿菌都是植物根際微生物(Rhizosphere microbe)，具有較強的植物根際定殖能力、抗逆能力和繁殖能力[4]。這不僅可以誘導作物抵抗逆境的能力，還可以通過汲取根際營養以及固定環境中的氮等元素促進植物生長，并通過磷轉運蛋白TaPHT1.8和TaPHT1.10 轉化環境中的化合態磷，通過系列生理作用為植物所利用，提高植物抵御農作物病害的能力[5]。解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)與枯草芽胞桿菌(B.subtillus)親緣關系十分相近，其產生的抑菌物質具有種類多、抑菌譜廣、抑菌活性強的特點，是近年來頗受關注的生防菌之一。Chen等[6]2007年公布了解淀粉芽胞桿菌 FBZ42 的全基因組測序，使得研究者在基因水平上對解淀粉芽胞桿菌的抑菌過程有了全面、深刻的認識，對多種次生代謝物的生產能力在分子水平上有了更深層次的了解，也促進了解淀粉芽胞桿菌在生物防治工程領域的利用。本文從解淀粉芽胞桿菌的發現、抑菌物質研究、抑菌功能基因、工程菌構建與開發應用等方面進行歸納總結，為解淀粉芽胞桿菌在生物防治領域的開發利用提供參考。

1 解淀粉芽胞桿菌的發現

解淀粉芽胞桿菌是1943年日本科學家Fukumoto發現的[7]，1967年Welker 在研究枯草芽胞桿菌降解淀粉和形成芽胞的異同時，首次將解淀粉芽胞桿菌從枯草芽胞桿菌中單列開來，因其具有很高的水解淀粉能力，命名為解淀粉芽胞桿菌[8]，直到1987年種的分類地位確立[9]。解淀粉芽胞桿菌隸屬芽胞桿菌屬(Bacillus)，菌落呈白色半透明，光滑濕潤，桿狀，革蘭陽性(G+)。其有兩個亞種：B.amyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciens和B.amyloliquefacienssubsp.plantarum，其中B.amyloliquefacienssubsp.plantarum亞種被普遍認為是具有植物促生長特性和產多種抑菌次級代謝產物的菌株[10]。解淀粉芽胞桿菌廣泛分布于土壤、植物體內、果蔬表面、植物堆肥、健康動物糞便中等，尤其在植物內生菌和根際微生物群落中極易篩選出有拮抗活性的解淀粉芽胞桿菌[11]。該菌株因其具有植物促生長作用和代謝產物的生防活性，是極具潛力的生防菌。解淀粉芽胞桿菌不僅可以抑制植物病原菌的生長，還可以增加經濟作物的果實數量和果實重量等[12]。研究表明，解淀粉芽胞桿菌生防菌制劑田間小試，具有抑菌譜廣、抑菌效率高、抑菌時效長等特點，極具大面積開發應用潛力。

2 解淀粉芽胞桿菌的抗菌機理研究

2.1 解淀粉芽胞桿菌的抗菌作用

解淀粉芽胞桿菌抑菌譜廣，作用明顯，抗菌代謝物質豐富多樣，主要體現在對真菌和細菌的抑制作用方面。其中對真菌的抑制作用主要表現在對灰葡萄孢、鏈格孢、叢梗孢、刺盤孢、尖鐮孢、金黃殼囊孢、曲霉、青霉、毛霉、核盤菌和鐮刀菌等病原真菌引起的果蔬病害的強抑制活性[11,13]。除實驗室內對病原菌的間接實驗外，Choiu等[14]證實解淀粉芽胞桿菌對離體果實和幼苗疫病同樣有一定的防治效果，尤其是對Alternariacosmosa和A.patula解淀粉芽胞桿菌的抑制效果甚至明顯高于其常用殺菌劑咪鮮胺和啶斑肟。對病原細菌的生防作用主要針對平菇褐斑菌、大白菜黑腐、假單胞菌屬病原菌、李斯特菌、陰道加德納菌、大腸埃希菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[11,15]等。除抗菌作用外，Chen等的研究表明，從麥冬植物里分離得到的解淀粉芽胞桿菌產生的胞外多糖，具有抗腫瘤功效[16]；解淀粉芽胞桿菌脂肽提取物(BLE)可以誘導細胞凋亡并抑制人口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖；細菌培養濾液對松材線蟲的致死率和蟲體消解率最高達到100%[17]。Chiou等[14]研究表明，通過培養基優化和誘變育種可以增加其抗菌活性和生物酶產量，可見解淀粉芽胞桿菌的抑菌作用還有很大的提高空間。

2.2 解淀粉芽胞桿菌的抗菌物質

關于芽胞桿菌代謝過程中產生的抑菌物質，不同菌株的產物各不相同。綜合歸納近年來有關芽胞桿菌的抗菌物質及抗菌作用(表1)，其中普遍認同的主要是抗菌脂肽、抗生素和水解酶類等。

表1 解淀粉芽胞桿菌抗菌物質及機理

2.3 解淀粉芽胞桿菌產生抗菌物質的相關基因

Chen 等于2007 年將解淀粉芽胞桿菌FZB42 全基因組序列公布[6]，到目前已有20 多株不同的解淀粉芽胞桿菌完成了全基因組測序。這為從基因水平研究解淀粉芽胞桿菌的抑菌機制提供了極大的方便，推動了從分子水平調控抗菌物質產生機理的研究。近年來有關解淀粉芽胞桿菌的基因操作、代謝工程改造方面取得的進展見表2。

表2 解淀粉芽胞桿菌抗菌基因

3 解淀粉芽胞桿菌生物防治基因工程菌的構建

20世紀40年代以來，隨著青霉素的生產與發展，微生物菌種選育技術成為現代發酵工業的基礎。為了降低發酵生產成本、提高發酵效率，研究人員采用了一系列的基因改良手段以期使其盡可能地發揮更大作用。1974年，波蘭遺傳學家Waclaw Szybalski提出的基因重組技術為此設想的實現奠定了基礎，直到1991年提出的代謝工程將分子育種和生物過程系統工程方法相結合，對胞內代謝網絡的諸多特征進行精確定量的分析，通過重組DNA 技術來賦予細胞理想的特性使工業微生物菌種改造取得了巨大的成果。趙延存等[33]利用60Co輻射誘變的解淀粉芽胞桿菌菌株處理的辣椒傷口腐爛面積下降64.4%；喬俊卿[2]將高產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽胞桿菌的bgl基因克隆到3 種不同的質粒載體中，分別轉化到不同大腸埃希菌宿主中表達，重組β-1,3-1,4-葡聚糖酶結合IPTG 和乳糖協同的誘導作用，在基礎產酶培養基中最高總酶活為(1 883.3±45.8) U/mL；Cantwell等[28]將β-1,3-1,4-葡聚糖酶用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切目的片段與表達載體pET-30a(+)相連接后，構建了重組表達載體pETamy，導入大腸埃希菌中表達，其酶活是出發菌的3倍；用一株解淀粉芽胞桿菌中性蛋白酶結構基因npr構建質粒pPIC9K-npr，并轉化到畢赤酵母中得到重組菌，酶活達9.17×103U/g，高于其他相關文獻得到的結果。Tsuge等[34]將B.subtilis的伊枯草菌素A 操縱子基因片段通過感受態細胞轉化到不含以上基因片段的B.subtilis基因組，然后再導入sfp基因和多向性調控基因degQ ，獲得基因工程菌株伊枯草菌素A 的產量是原始菌株的7 倍，同時發現基因degQ 在其中起到關鍵的調控作用。

4 解淀粉芽胞桿菌抗性產品的開發

目前國內外均有基于芽胞桿菌為主要抑菌活性開發生防菌劑的發明專利。國外研究較早，且已將其成功應用于多個領域。美國食品藥品管理局(FAD)已把某些種類的芽胞桿菌定為可直接飼喂動物的微生物(DFM)；美國解淀粉枯草芽胞桿菌變種獲得美國環保局(EPA)商品化或有限商品化生產應用許可；德國Abitep GmbH公司將解淀粉芽胞桿菌(FZB42)作為植物促生長劑，并成功開發為商品[35]；日本東京研究所研發的商品菌B.subtilisRB14 和美國Taensa 公司研發的商品菌B.amyloliquefaciensFZB42，主要用于防治農作物的枯萎病和根腐病[5]。而國內關于解淀粉芽胞桿菌的專利產品等主要應用于農業生產，且多集中在三種形式。①殺菌劑：南京農業大學[2]研制成一種防治香蕉枯萎病的殺菌劑，溫室防效為52.37%～77.78%；黃亞麗[36]開發的微生物菌劑防治花生葉斑病。②生物菌肥：周波等[37]發明一種生物菌肥，有效防治馬鈴薯瘡痂病。③可濕性粉劑：張榮勝[38]開發了噻枯唑復配可濕性殺菌粉劑，用于防治水稻細菌性條斑病或水稻白葉枯病；張海華[39]將其用于防治煙草、番茄和辣椒等作物的青枯??；徐超等[40]證實其對無花果、鐵皮石斛果實的多種病原菌具有抑制作用。并且，因此而開發出了一系列抑菌產品，主要有枯草芽胞桿菌Bs-208殺菌劑、菜豐寧(枯草芽胞桿菌)、威綠達(綠色木霉為主, 毛殼菌、枯草芽胞桿菌為輔混配制成)、亞寶(枯草芽胞桿菌)、百抗(枯草芽胞桿菌)等生防制劑。

5 展 望

化學農藥在農業病害防治過程中起到巨大的作用，但長期使用其負面效應也越來越突出。尋找和開發綠色、環保、安全、低成本的生物防治制劑，實現高效、低毒、無害化、無殘留的生物預防和保鮮方法，具有重要現實意義。

解淀粉芽胞桿菌可產生多種抑菌活性物質，其分布廣，抑菌產物豐富且抑菌譜廣，代謝產物具有良好的離體和活體抑制活性，是一種極具生防潛力的菌株。隨著分子生物學技術的發展，解淀粉芽胞桿菌的基因組測序和功能解析取得了巨大進展。這對解淀粉芽胞桿菌的開發應用提供了強有力的支撐。但有關該菌的抑菌作用機制、基因產物及毒理作用等方面的研究還需進一步完善，未來會有更多的以解淀粉芽胞桿菌為主要抗菌活性成分的生防菌劑被開發和應用。

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Funds Projecd:This article supported by Youth foundation of Lanzhou Jiaotong University(2014011)

Author profile：zhao mengmeng, female, associate professor, doctor in reading.

Research direction: Microbial physiology and biochemistry and its application. Tel: 0931-4938793，E-mail: zhaomm80@163.com

Draft accepted date:2015-06-02; Revision returned date:2015-07-03

The Latest Advances in Bio-ControlBacillusamyloliquefaciens

LI Hong-xiao1, 2, ZHANG Dian-peng2, LU Cai-ge2, ZHAO Hong-xin1,3

(1.Coll.ofChem. &LifeSci.,ShenyangNormalUni.,Shenyang110034; 2.Inst.ofPlant&Environ'tProtect'n,BeijingAcad.ofAgric. &Forest.Sci.,Beijing100097; 3.ZhejiangProv.KeyLab.ofPlantSecondaryMetabol. &Regul'n,Coll.ofLifeSci.,ZhejiangSci-TechUni.,Hangzhou310018)

Bacillusamyloliquefaciensis a strain similar toB.subtilis, a beneficial microbe that can produce spore, Gram-positive, and possessing biocontrolling activity. During its metabolism it produces antibiotic substance, a variety of antibiotic preparations or antibiotic extracts with broad antibiotic spectrum, non toxic, non harms, non residues, long effectiveness for a given period of time, and other advantages. It can be widely applied in keeping fruits and vegetables fresh, and in biocontrolling microbial pests during their growth and post-harvest. It is a very ideal biocontrolling microbe with the most developing value. In this paper the studies, the current application ofB.amyloliquefacienswere drawn and summarized from aspect of the antibiotic mechanism, the antibiotic gene component, the establishment of genetic engineering strain, the development of resistance products, the controlling against microbial pests, and other aspects, and accordingly to provide references for its large-scale safety application in agricultural bio-engineering.

Bacillusamyloliquefaciens; antibacterial substances; biocontrol effect; resistance gene

遼寧省科學公益基金項目(2014003020)；北京市農林科學院青年科研基金(QNJJ201317)；北京市優秀人才培養資助項目(2013D002020000005)

李紅曉 女，碩士研究生。主要從事生物防治微生物研究。E-mail:18515344607@126.com

* 通訊作者。男，教授，碩士生導師。主要從事資源微生物的開發利用。E-mail:bxxbj2003@gmail.com

2015-10-15；

2015-11-06

Q939.9

A

1005-7021(2016)02-0087-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.02.015