刺山柑總生物堿對系統性硬皮病小鼠基質金屬蛋白酶及其抑制劑的影響

康小龍，劉晶，何承輝，盧軍，楊俊玲

1.新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004

刺山柑總生物堿對系統性硬皮病小鼠基質金屬蛋白酶及其抑制劑的影響

康小龍1，劉晶1，何承輝2，盧軍1，楊俊玲1

1.新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004

目的 觀察刺山柑總生物堿對系統性硬皮病（SSc）小鼠Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）和纖溶酶原激活物抑制因子-1（PAI-1）水平的影響，探討其抗SSc組織纖維化的作用機制。方法 BALB/c小鼠90只隨機分為空白對照組、模型組、青霉胺組及刺山柑總生物堿低、中、高劑量組。除空白對照組外，其余各組小鼠背部注射鹽酸博萊霉素建立SSc模型。成模后刺山柑總生物堿組小鼠背部外敷不同劑量刺山柑總生物堿乳膏，青霉胺組予青霉胺灌胃，空白對照組、模型組背部外敷不含藥基質，每日1次，連續60 d。末次給藥后，ELISA檢測小鼠皮膚Col-Ⅳ和血清MMP-9、TIMP-1、PAI-1含量。結果 與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組小鼠血清MMP-9含量及MMP-9/TIMP-1比值升高，血清TIMP-1及皮膚Col-Ⅳ含量降低（P＜0.05，P＜0.01），但對PAI-1水平無明顯影響（P＞0.05）。結論 刺山柑總生物堿可通過調節MMP-9/TIMP-1失衡，減少Col-Ⅳ合成，改善SSc組織纖維化。

刺山柑總生物堿；系統性硬皮病；Ⅳ型膠原；基質金屬蛋白酶-9；基質金屬蛋白酶抑制劑-1；纖溶酶原激活物抑制因子-1；小鼠

系統性硬皮病（systemic sclerosis，SSc）是一種病因不明的慢性多系統疾病，以皮膚組織器官纖維化為特征。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）及其抑制劑-1（TIMP-1）和纖溶酶原激活物抑制因子-1（PAI-1）可能在SSc細胞外基質（ECM）的合成中起了重要作用。刺山柑Capparis spinosa L.為白花菜科Capparaceae山柑屬Capparis L.植物，系維吾爾醫習用藥材之一。前期研究表明，刺山柑乙醇提取物可抑制SSc患者成纖維細胞增殖及Ⅰ型膠原的合成[1]；刺山柑鮮果75％乙醇調制的糊膏及刺山柑流浸膏均能顯著抑制硬皮病模型小鼠的真皮增厚、膠原沉積[2]。本課題組從刺山柑中提取有效部位刺山柑總生物堿，觀察其對SSc小鼠Ⅳ型膠原（Col-Ⅳ）、MMP-9、TIMP-1和PAI-1水平的影響，探討其抗SSc組織纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

刺山柑藥材購自新疆麥迪森維藥有限公司飲片廠，經新疆維吾爾自治區藥物研究所何江研究員鑒定為正品；鹽酸博萊霉素粉針劑，日本化藥株式會社，批號430312；青霉胺片，上海信誼藥廠，批號052130503。刺山柑總生物堿乳膏制備方法：將刺山柑總生物堿與基質（硬脂酸、白凡士林、單硬脂酸甘油酯、月桂氮卓酮）混勻，于水浴加熱至90 ℃使熔融，做為油相；甘油與濃縮液混合，于水浴加熱至90 ℃做為水相；十二烷基硫酸鈉、對羥基苯甲酸乙酯溶于適量水中，于水浴加熱使溶解為乳化劑，當油相、水相溫度降至85 ℃時，依次將水相和乳化劑加入油相中，邊加邊攪拌至乳化完全。

1.2 動物

8周齡清潔級BALB/c小鼠90只，體質量18～24 g，新疆實驗動物研究中心，合格證號SCXK（新）2003-0002，置于清潔級環境，普通飼料和水飼養。

1.3 主要試劑與儀器

小鼠MMP-9 ELISA試劑盒（批號201502）、小鼠TIMP-1 ELISA試劑盒（批號201502），上海泛科生物科技公司；小鼠PAI-1 ELISA試劑盒（批號E11030163），武漢華美生物科技公司；小鼠Col-ⅣELISA試劑盒（批號201502），上海江萊生物科技公司；二辛可寧酸蛋白定量試劑盒（批號20150223），江蘇碧云天生物技術研究所。酶標儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.4 分組、造模與給藥

實驗小鼠隨機分為空白對照組、模型組、青霉胺組（125 mg/kg）和刺山柑總生物堿低（225 mg/kg）、中（450 mg/kg）、高（900 mg/kg）劑量組，每組15只，實驗前用剃毛刀將背部毛剃除。采用博萊霉素皮下注射制備SSc動物模型[3]，造模組小鼠背部皮下注射300 μg/mL，每日1次，每次0.1 mL，共4周，觀察小鼠背部注射部位皮膚是否出現皮膚增厚、彈性變差等變化。4周后，刺山柑總生物堿組小鼠背部外敷不同劑量的刺山柑總生物堿乳膏，青霉胺組給予青霉胺灌胃，空白對照組和模型組背部外敷不含藥基質，1次/d，連續60 d。

1.5 小鼠皮膚Ⅳ型膠原含量測定

末次給藥后4 h，取小鼠背部注射區皮膚制成10％組織勻漿，4000 r/min離心10 min，提取上清液分裝，二辛可寧酸蛋白定量試劑盒測定皮膚勻漿液中蛋白濃度，ELISA試劑盒檢測勻漿液中Col-Ⅳ含量，操作按試劑盒說明書進行，測定結果以每1 mL勻漿液中蛋白含量進行校正。

1.6 小鼠血清基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶抑制劑-1和纖溶酶原激活物抑制因子-1含量測定

末次給藥后4 h，摘除眼球采血，4000 r/min離心10 min，分離血清，ELISA試劑盒檢測血清中MMP-9、TIMP-1和PAI-1含量，按試劑盒說明書進行操作。

1.7 統計學方法

采用SPSS11.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對模型小鼠皮膚Ⅳ型膠原含量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚Col-Ⅳ含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，刺山柑總生物堿各劑量組和青霉胺組皮膚Col-Ⅳ含量明顯降低（P＜0.01）。結果見表1。

表1　各組小鼠皮膚Col-Ⅳ含量比較（s）

表1　各組小鼠皮膚Col-Ⅳ含量比較（s）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

組別 只數劑量/（mg/kg） Col-Ⅳ/（pg/mg）空白對照組 15 5.03±0.80模型組 15 10.01±1.02##刺山柑總生物堿低劑量組 15 225 8.62±1.32**刺山柑總生物堿中劑量組 15 450 7.98±0.68**刺山柑總生物堿高劑量組 15 900 7.38±1.09**青霉胺組 15 125 8.14±0.93**

2.2 對模型小鼠血清基質金屬蛋白酶-9、基質金屬蛋白酶抑制劑-1和纖溶酶原激活物抑制因子-1含量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清MMP-9含量明顯降低、TIMP-1含量明顯升高（P＜0.01），PAI-1含量無明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，刺山柑總生物堿中、高劑量組和青霉胺組MMP-9含量及MMP-9/TIMP-1比值升高（P＜0.05，P＜0.01），刺山柑總生物堿高劑量組和青霉胺組TIMP-1含量降低（P＜0.01），刺山柑總生物堿各劑量組和青霉胺組PAI-1含量無明顯差異（P＞0.05）；與青霉胺組比較，刺山柑總生物堿高劑量組血清MMP-9、TIMP-1含量及MMP-9/TIMP-1比值無明顯差異（P＞0.05）。結果見表2。

表2　各組小鼠血清MMP-9、TIMP-1、PAI-1含量及MMP-9/TIMP-1比值比較（±s）

表2　各組小鼠血清MMP-9、TIMP-1、PAI-1含量及MMP-9/TIMP-1比值比較（±s）

組別 只數 劑量/（mg/kg）MMP-9/（pg/mL） TIMP-1/（pg/mL） MMP-9/TIMP-1 PAI-1/（ng/mL）空白對照組 15 14.44±1.91 7.68±1.62 1.94±0.40 17.84±2.13模型組 15 8.73±1.97##11.65±1.72##0.77±0.24##19.36±3.60刺山柑總生物堿低劑量組 15 225 9.60±2.18 12.01±2.30 0.83±0.23 18.33±3.12刺山柑總生物堿中劑量組 15 450 10.73±2.22*10.83±2.53 1.04±0.33*19.16±2.97刺山柑總生物堿高劑量組 15 900 11.52±2.43**8.38±1.82**1.42±0.40**18.04±2.79青霉胺組 15 125 12.32±1.84**8.86±1.86**1.45±0.37**16.66±3.79

3 討論

基質金屬蛋白酶（MMPs）是一組鋅離子依賴的內肽酶，是ECM降解過程中必不可少的酶類，幾乎能降解ECM的所有成分，其活性可被TIMPs抑制，其中MMP-9是MMPs家族中的主要成分，是降解Col-Ⅳ最主要的酶，MMP-9受MMP相應的負性調節劑TIMP-1的抑制，抑制其對ECM的降解，MMP-9與TIMP-1的活性平衡對于維持ECM的穩定至關重要。Kikuchi等[4]研究顯示，SSc患者血清MMP-9活性水平明顯降低，且MMP-9含量與調整的Rodnan皮膚厚度指數呈負相關，提示血清MMP-9水平可作為SSc疾病活動性尤其是皮膚病變嚴重程度的一個指標。Giannelli等[5]檢測了SSc肺動脈高壓患者血清中MMP-9含量，結果肺動脈高壓患者的血清MMP-9含量顯著降低，經波生坦治療癥狀改善后，再次進行同樣檢測，患者血清MMP-9含量顯著升高，從而認為升高MMP-9活性可能對SSc有一定的治療作用，這項研究表明MMP-9水平可能可用于判斷某些藥物治療SSc的療效。Kuroda等[6]檢測了SSc患者和正常人皮膚成纖維細胞TIMP-1 mRNA的表達，結果SSc患者TIMP-1 mRNA表達明顯高于對照組。Bou-Gharios等[7]用流式細胞技術檢測SSc患者成纖維細胞合成的TIMP-1較正常對照高50％，TIMP-1是評估SSc嚴重程度的指標。本研究發現，刺山柑總生物堿中、高劑量可降低SSc小鼠皮膚Col-Ⅳ及血清TIMP-1水平，升高血清MMP-9水平及MMP-9/TIMP-1比值，本課題組前期研究亦表明，刺山柑總生物堿可使SSc小鼠真皮鱗狀上皮變薄，膠原纖維明顯減少，減少Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成，提示刺山柑總生物堿可能通過增加MMP-9表達，抑制TIMP-1表達，使SSc ECM降解增加，減少膠原合成，改善SSc組織纖維化。

尿激酶/組織型纖溶酶原激活物（uPA/tPA）和纖溶酶對維持體內ECM合成和分解平衡有重要調節作用，且其活性受uPA/tPA的抑制劑PAI-1的調節。PAI-1對機體有保護性調節作用，若生成過多可因過度抑制uPA/tPA和纖溶酶而導致膠原和其他ECM生成過多，引起多器官和組織纖維化。本研究結果顯示，各組小鼠血清PAI-1水平未見明顯差異，提示刺山柑總生物堿可能對SSc PAI-1水平無影響。

綜上，刺山柑總生物堿可通過調節MMP-9/TIMP-1失衡，減少Col-Ⅳ合成，改善SSc組織纖維化。

[1]曹越蘭,李欣,王群.槌果藤對硬皮病小鼠模型皮膚硬化抑制作用的實驗研究[J].中國中藥雜志,2008,33(2)：215-217.

[2]曹越蘭,李欣,鄭敏.槌果藤對進行性系統性硬化癥患者成纖維細胞增殖和Ⅰ型膠原產生的影響[J].中國中藥雜志,2008,33(5)：560-562.

[3]沈佚葳,王京,周平.阿維A對硬皮病小鼠的治療作用及機制研究[J].中國醫藥導報,2013,10(25)：20-22.

[4]KIKUCHI K, KUBO M, HOASHI T, et al. Decreased MMP-9 activity in the serum of patients with diffuse cutaneous systemic scleroderma[J]. Clin Exp Dermatol,2002,27(4)：301-305.

[5]GIANNELLI G, IANNONE F, MARINOSCI F, et al. The effect of bosentan on matrix metalloproteinase-9 levels in patients with systemic scleroderma-induced pulmonary hypertension[J]. Curr Med Res Opin,2005,21(3)：327-332.

[6]KURODA K, SHINKAI H. Gene expression of types Ⅰ and Ⅲcollagen, decorin, matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in skin fibroblasts from patients with systemic scleroderma[J]. Arch Dermatol Res,1997, 289(10)：567-572.

[7]BOU-GHARIOS G, OSMAN J, BLACK C, et al. Excess matrix accumulation in scleroderma is caused partly by differential regulation of stromelysin and TIMP-1 synthesis[J]. Clin Chim Acta,1994,231(1)：69-78.

Effects of Capparis Spinosa Total Alkaloid on MMP-9 and TIMP-1 Levels in Systemic

Sclerosis Mice

KANG Xiao-long1, LIU Jing1, HE Cheng-hui2, LU Jun1, YANG Jun-ling1(1. Hospital of Chinese

Medicine Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China; 2. Xinjiang Medicine Research Institute, Urumqi 830004, China)

Objective To investigate the effects of capparis spinosa total alkaloid on type Ⅳ collagen (Col -Ⅳ), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in bleomycin-induced systemic sclerosis (SSc) mice; To explore the effective mechanism of capparis spinosa total alkaloid on fibrosis of SSc. Methods Totally 90 BALB/c mice were randomly divided into control group, model group, penicillamine group and capparis spinosa total alkaloid low-, medium- and high-dose group. Mice models with SSc were established by repeated local injections of bleomycin in mice back, except for the control group. Mice in medication groups

external application with capparis spinosa total alkaloid cream; mice in penicillamine group were given penicillamine for gavage; mice in the control and model group

external application without substance, one time a day, for 60 days. The contents of MMP-9, TIMP-1 and PAI-1 in serum and Col-Ⅳ in skin tissue were detected respectively by ELISA after the last medication. Results Compared with the model group, the levels of MMP-9 and ratio of MMP-9/TIMP-1 markedly increased and the levels of Col-Ⅳ and TIMP-1 markedly decreased in medium and high- dose of capparis spinosa total alkaloid group (P<0.05, P<0.01). But the level of PAI-1 was not influenced (P>0.05). Conclusion Capparis spinosa total alkaloid is effective in treating fibrosis of SSc by adjusting imbalance of MMP-9/TIMP-1 and decreasing expression of Col-Ⅳ.

capparis spinosa total alkaloid; systemic sclerosis; type Ⅳ collagen; MMP-9; TIMP-1; PAI-1; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.014

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0051-03

國家自然科學基金（81260235）

何承輝，E-mail：408705201@qq.com

（2015-05-29）

（2015-06-21；編輯：華強）