糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經p38絲裂素活化蛋白激酶及血漿腫瘤壞死因子-α表達的影響

呂翠巖，張勝容，徐暾海，孫文，趙文景，張竹華，鄭桂敏，孟元，王暉，劉銅華

1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2.北京中醫藥大學，北京 100029

糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經p38絲裂素活化蛋白激酶及血漿腫瘤壞死因子-α表達的影響

呂翠巖1，2，張勝容1，徐暾海2，孫文2，趙文景1，張竹華1，鄭桂敏1，孟元1，王暉1，劉銅華2

1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2.北京中醫藥大學，北京 100029

目的 觀察中藥復方糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經p38絲裂素活化蛋白激酶（p38 MAPK）及血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響，探討其神經保護及鎮痛機制。方法 SD雄性大鼠60只，隨機選取10只為正常組，其余大鼠采用高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素誘發2型糖尿病大鼠模型。成模后隨機分為模型組、甲鈷胺組和糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。各給藥組給予相應藥物干預。16周后取大鼠一側坐骨神經，放免法檢測大鼠血漿TNF-α含量；Western blot檢測大鼠坐骨神經p38、p-p38 MAPK蛋白表達。結果 與正常組比較，模型組大鼠坐骨神經p38、p-p38蛋白表達及血漿TNF-α含量升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿TNF-α含量和坐骨神經p-p38蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組p38蛋白表達降低，但只有糖痹康高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 糖痹康下調大鼠坐骨神經p38、p-p38 MAPK蛋白表達和血漿TNF-α含量，可能是其糖尿病周圍神經病變神經保護及鎮痛作用靶點之一。

糖痹康；糖尿病周圍神經病變；p38絲裂原活化蛋白激酶；腫瘤壞死因子-α；大鼠

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是由糖尿病導致的周圍神經系統病變，特點是由于對稱的遠端周圍神經組織退化，導致其感覺的痛苦和缺失。本實驗在前期研究基礎上，采用高脂飼料和小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘發2型糖尿病大鼠模型，觀察中藥復方糖痹康對模型大鼠坐骨神經p38絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）及血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響，探討其神經保護及鎮痛機制。

1 實驗材料

1.1 動物

6周齡SPF級SD雄性大鼠60只，體質量（160± 10）g。許可證號SCXK（京）2004-0009，北京維通利華動物實驗中心。北京中醫藥大學實驗動物中心飼養，溫度（23±2）℃，濕度（55±10）％，光照12 h，噪音＜60 dB，自由攝食飲水，分籠喂養。

1.2 藥物與飼料

糖痹康由黃芪、女貞子、桂枝、黃芩、黃連等組成，飲片由北京中醫藥大學中藥學院提供；甲鈷胺片，衛材（中國）藥業有限公司制造，批號111109A。高脂飼料，北京華阜康生物科技有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

TNF-α放射免疫試劑盒（北京華力特生物技術研究所），p38、p-p38為兔來源的單克隆抗體（美國CST公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）。硝酸纖維素膜（德國Millipore），穩壓穩流電泳儀、垂直電泳槽、半干轉電轉印儀（美國Bio-Rad），電子天平Sartouris（德國BS224S），紫外分光光度計eppendorf（德國Biophotometer）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

大鼠適應性喂養1周，隨機選取10只為正常組，普通飼料喂養。其余喂高脂飼料，8周后參考文獻[1]造模，予STZ 35 μg/g腹腔內注射。72 h后檢測尾尖血血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L為造模成功。成模大鼠隨機分為模型組、甲鈷胺組和糖痹康低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 給藥

血糖穩定3 d后開始灌胃給藥。糖痹康低、中、高劑量組分別按成人劑量5、10、20倍給藥，分別為4.175、8.35、16.7 g原藥材/（g·d），均換算成糖痹康為3 mL灌胃；甲鈷胺組按成人劑量10倍給藥，即1.97 mg/（g·d）, 用蒸餾水配成混懸液3 mL灌胃；空白組和模型組給予等量生理鹽水。實驗期間大鼠自由飲食飲水，連續16周。

2.3 指標檢測

2.3.1 腫瘤壞死因子-α含量檢測 給藥16周后，大鼠10％水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈采血2 mL，置于預冷的含7.5％ EDTA 30 μL和抑肽酶40 μL無菌采血管中混勻，-4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血漿，放入-80 ℃冰箱備用。采用放免法檢測血漿TNF-α含量，按試劑盒說明書操作。

2.3.2 p38絲裂素活化蛋白激酶蛋白表達檢測 給藥16周后，按350 mg/100 g劑量10％水合氯醛腹腔注射麻醉，取4 cm左右大鼠坐骨神經置于凍存管，迅速投入液氮中保存。Western-blot檢測p38 MAPK蛋白表達。從液氮中取出部分組織研磨，經組織裂解液裂解后上樣電泳，初始電壓80 V，待溴酚藍染料前緣進入分離膠上緣后提高電壓至100 V，直至溴酚藍泳出分離膠下緣結束電泳。采用半干電轉移儀在PVDF膜上進行蛋白質電轉移，恒流30 mA，持續90 min。取出PVDF膜用5％TBST脫脂奶粉封閉，室溫振蕩60 min。封閉結束后，用TBS-T漂洗液洗10 min×3次，將膜移入雜交袋中，加用漂洗液稀釋的抗體（p38、p-p38均為1∶1000），封口，4 ℃孵育過夜；再用TBST漂洗液洗10 min×3次，加漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗（p38、p-p38均為1∶1000），37 ℃振蕩60 min。將PVDF膜置ECL顯色液中于室溫下振蕩溫育5 min，于暗室中曝光、顯影、定影。清水沖洗后，晾干保存，掃描，使用IPP軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析。

3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 糖痹康對模型大鼠血漿腫瘤壞死因子-α的影響

與正常組比較，模型組大鼠血漿TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血漿TNF-α含量顯著降低（P＜0.01）。結果見表1。

4.2 糖痹康對模型大鼠坐骨神經p38絲裂素活化蛋白激酶表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠坐骨神經p38、p-p38蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組p-p38蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組p38蛋白表達降低，但只有糖痹康高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2、圖1。

表1　各組大鼠血漿TNF-α含量比較（±s，ng/mL）

表1　各組大鼠血漿TNF-α含量比較（±s，ng/mL）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 只數 TNF-α正常組 10 1.24±0.14模型組 10 4.57±1.11**甲鈷胺組 10 1.37±0.34##糖痹康低劑量組 10 2.81±0.60##糖痹康中劑量組 10 2.24±0.37##糖痹康高劑量組 10 1.35±0.34##

表2　各組大鼠坐骨神經p38和p-p38 MAPK蛋白表達比較（±s）

表2　各組大鼠坐骨神經p38和p-p38 MAPK蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 n p38 p-p38正常組 3 0.34±0.15 0.22±0.80模型組 3 0.86±0.30*0.76±0.13**甲鈷胺組 3 0.76±0.31 0.56±0.64#糖痹康低劑量組 3 0.87±0.21 0.57±0.18#糖痹康中劑量組 3 0.60±0.10 0.39±0.05##糖痹康高劑量組 3 0.46±0.10#0.47±0.10##

圖1　各組大鼠坐骨神經p38和p-p38 MAPK蛋白免疫印跡圖

5 討論

糖痹康組方源自黃芪桂枝五物湯（《金匱要略?血痹虛勞病脈證并治》）。既往實驗研究表明，糖痹康可提高STZ誘導的DPN大鼠周圍神經傳導速度，改善神經病理，提高坐骨神經Na+-K+-ATP酶活性和cAMP、cGMP含量，且存在劑量依賴關系，對DPN有一定的保護作用；改善STZ誘導的DPN大鼠脂質代謝，升高血清超氧化物歧化酶、一氧化氮合成酶、一氧化氮含量，降低丙二醛含量，減輕氧化應激造成的周圍神經損害，具有抗氧化應激作用，顯著上調DPN大鼠血漿β-內啡肽的表達，具有神經保護作用及鎮痛作用[2-6]。

p38 MAPK是MAPK超家族重要成員之一，與DPN關系最密切的成員，是目前研究最多的氧化應激信號轉導通路。激活后的MAPK可停留在胞質中，激活其他蛋白酶，使細胞骨架結合蛋白磷酸化；也可經核轉位進入細胞核，磷酸化核轉錄因子，調控基因表達，促進相關蛋白質的合成和通道改變。DPN患者腓腸神經中p38總體水平升高[7]。糖尿病神經病理痛是DPN患者最常見、嚴重影響患者生活質量的癥狀之一，同時其發生的信號轉導機制目前尚不清楚。研究表明，p38 MAPK在糖尿病神經病理性疼痛中起關鍵作用[8]，同時炎性通路的激活是造成DPN的重要途徑之一。TNF-α是一種重要的炎癥因子，與DPN的發生發展關系密切。越來越多的資料表明，免疫和炎前介質，尤其TNF-α在外周神經病理性疼痛的發生及維持中起著重要作用[9]，其與p38 MAPK之間錯綜復雜的關系更成為研究的熱點之一。實驗結果表明，模型組大鼠坐骨神經組織p38、p-p38 MAPK蛋白表達和血漿TNF-α含量較正常組顯著升高；糖痹康各劑量組p38、p-p38 MAPK蛋白表達和TNF-α含量較模型組顯著降低。由此，我們推測糖痹康可下調糖尿病大鼠坐骨神經p38、p-p38 MAPK蛋白表達和血漿TNF-α含量，可能是其DPN神經保護及鎮痛作用靶點之一。

[1]吳晏,韓靜,黃黎明,等.高脂喂養合并小劑量鏈脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型[J].中國實驗動物學報,2012,20(2)：11-15.

[2]王佳,劉銅華.糖痹康對糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經傳導速度的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志,2010,16(3)：209-211.

[3]王佳,劉銅華.糖痹康對大鼠糖尿病周圍神經病變氧化應激影響的實驗研究[J].國際中醫中藥雜志,2010,32(4)：296-298.

[4]呂翠巖,張勝容,趙文景,等.中藥復方糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經BDNF蛋白及BDNF mRNA表達的影響[J].中國中醫基礎醫學雜志,2015, 21(2)：168-171.

[5]呂翠巖,張勝容,趙文景,等.中藥復方糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經NGF、BDNF及NT-3蛋白表達的影響[J].中華中醫藥雜志,2014,29(12)：3946-3949.

[6]呂翠巖,李秋明,毛穎秋,等.糖痹康對糖尿病周圍神經病變大鼠血漿β-內啡肽的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2014,21(4)：49-52.

[7]PURVES T, MIDDLEMAS A, AGTHONG S, et al. A role form itogen activated protein kinases in the etiology of diabetic neuropathy[J]. FASEB J,2001,15(13)：2508-2514.

[8]柯昌斌,黃曉霞,許先成,等.P38MAPK和PI3K/Akt信號通路在大鼠糖尿病神經病理性疼痛中的交互作用[J].中華麻醉學雜志,2010,9(26)：701-703.

[9]MOALEM G, TRACEY D J. Immune and inflammatory mechanisms in neuropathic pain[J]. Brain Res Rev,2006,51：240-264.

Effects of Tangbikang on the Expressions of p38 MAPK of Sciatic Nerve and Plasma TNF-α

in Diabetic Rats

LV Cui-yan1,2, ZHANG Sheng-rong1, XU Tun-hai2, SUN Wen2, ZHAO Wen-jing1,

ZHANG Zhu-hua1, ZHENG Gui-min1, MENG Yuan1, WANG Hui1，LIU Tong-hua2(1. Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100010, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To explore the effects of Chinese herbal compound Tangbikang on the expressions of p38 MAPK of sciatic nerve and plasma TNF-α in diabetic rats. Methods Ten of the sixty male SD rats were selected randomly as normal group, and the rest were fed with high-fat diet and low-dosage STZ was used to induce type Ⅱdiabetic rat models. Model rats were randomly divided into model group, mecobalamine group and Tangbikang low-, medium-, and high-dosage groups, 10 rats in each group. Each medication group was intervened with relevant medicine. Rat unilaterals sciatic nerves were taken after 16 weeks. The content of TNF-α in plasma was determined by radioimmunoassay. Western blot method was used to detect the expressions of p38 and p-p38 MAPK protein of sciatic nerve. Results Compared with normal group, the expressions of p38 and p-p38 protein and content of TNF-α in model group significantly increase (P<0.05, P<0.01). Compared with the model group, the expressions of p-p38 protein and the content of TNF-α significantly decreased after medicine intervention in different doses Tangbikang groups and mecobalamin group (P<0.05, P<0.01). The expression of p38 protein in Tangbikang high-dose group significantly decreased (P<0.05), with statistical significance (P<0.05). Conclusion Tangbikang can reduce the expression of p38 and p-p38 MAPK protein of the rat sciatic nerve, and reduce the content of TNF-α protein in rat plasma, which may be one of the effective targets of neuroprotection and abirritation of diabetic peripheral neuropathy.

Tangbikang; diabetic peripheral neuropathy; p38 MAPK; TNF-α; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.018

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0067-03

國家科技重大專項-重大新藥創制（2012ZX09102201-001）；教育部博士點基金立項課題（20110013130001）；北京中醫藥科技發展資金項目（JJ2015-06）；北京中醫藥大學創新團隊項目（2011-CXTD-19）

劉銅華，E-mail：thliu@tom.com

（2015-04-21）

（2015-06-30；編輯：華強）