青藤堿對兔膝骨關節炎模型軟骨及滑膜血管內皮生長因子和神經生長因子表達的影響

鄭潔，王瑞輝，寇久社，羅浩

1.陜西中醫藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學第二附屬醫院，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫藥大學醫學技術學院，陜西 咸陽 712046

·實驗研究·

青藤堿對兔膝骨關節炎模型軟骨及滑膜血管內皮生長因子和神經生長因子表達的影響

鄭潔1，王瑞輝1，寇久社2，羅浩3

1.陜西中醫藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學第二附屬醫院，陜西 咸陽 712046；3.陜西中醫藥大學醫學技術學院，陜西 咸陽 712046

目的 觀察青藤堿關節腔注射對兔膝骨關節炎模型軟骨及滑膜血管內皮生長因子（VEGF）和神經生長因子（NGF）表達的影響，探討其相關機制。方法 采用木瓜蛋白酶關節腔注射法誘導膝骨關節炎模型。40只新西蘭大白兔隨機分為空白組、模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組，空白組不予任何處理，模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組分別給予生理鹽水、玻璃酸鈉注射液和正清風痛寧注射液干預30 d，免疫組化檢測兔關節軟骨及滑膜VEGF、NGF的表達。結果 與空白組比較，模型組軟骨及滑膜VEGF、NGF表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，青藤堿組軟骨及滑膜VEGF、NGF表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；青藤堿組軟骨及滑膜VEGF、NGF表達低于透明質酸鈉組（P＜0.05，P＜0.01）。結論 青藤堿膝關節腔注射可下調VEGF和NGF在膝骨關節炎兔關節軟骨及滑膜的表達。

青藤堿；骨關節炎；血管內皮生長因子；神經生長因子；兔

血管生成對于組織的生長、發育、再生循環及修復等生理過程極為重要，在一些疾病的病理改變中也發揮了不可忽視的作用。近年來發現，組織血管生成參與了骨關節炎（osteoarthritis，OA）病理進程，與OA關節軟骨退變及關節疼痛密切相關。膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）患者骨贅、關節軟骨、滑膜及半月板等結構均有血管生成或新生血管增多。血管生成與神經生長是一個緊密聯系的過程，OA關節骨軟骨連接處、骨贅及半月板內新生血管形成的同時還伴隨著感覺神經的生長，這是造成關節疼痛的一個不可忽視的重要因素，近年來逐漸受到關注。青藤堿是從青風藤中提取的一種生物堿，具有鎮痛、抗炎、調節免疫等作用。臨床觀察發現青藤堿對改善OA疼痛癥狀具有明顯作用[1]。我們前期實驗研究發現，青藤堿關節腔注射可緩解KOA兔滑膜炎性反應，降低關節液軟骨降解標志物含量，對軟骨具有保護作用[2]。本實驗觀察青藤堿關節腔注射對KOA兔關節軟骨及滑膜組織中促血管生成因子血管內皮生長因子（VEGF）和神經生長因子（NGF）表達的影響，進一步探討青藤堿緩解OA關節痛及軟骨保護作用的機制。

1 實驗材料

1.1 動物

新西蘭大白兔40只，雌雄各半，4～6月齡，體質量1.8～2.2 kg，西安交通大學醫學院實驗動物中心，合格證號SCXK（陜）2008-008。單籠、標準飼料喂養，室溫20～25 ℃，相對濕度45％～60％，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.2 藥物

正清風痛寧注射液，湖南正清制藥集團股份有限公司，批號1304402-003；玻璃酸鈉注射液，山東博士倫福瑞達制藥有限公司，批號130308011。

1.3 主要試劑與儀器

VEGF和NGF一抗，北京博奧森生物技術有限公司；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒和辣根酶標記兔抗山羊IgG二抗，武漢博士德生物工程有限公司；木瓜蛋白酶，Merck公司。超薄切片機，德國LEICA公司；TKY-TKA型攤片烤片機，湖北泰康醫療設備有限公司；ZEISS研究級正置數碼顯微鏡，德國ZEISS公司。

2 實驗方法

2.1 造模、分組與給藥

40只兔分為空白組8只和造模組32只，采用木瓜蛋白酶注射法于實驗第1、4、7日對造模組兔右膝關節腔注射4％木瓜蛋白酶溶液0.5 mL（20 mg），首次注射4周后隨機處死2只兔，病理學觀察出現典型軟骨退變表現，同時兔右膝關節出現腫脹、跛行，表明造模成功。將成模兔隨機分為模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組，每組10只。根據成人用藥劑量（玻璃酸鈉和青藤堿均為2 mL/次）按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量。除空白組外，其余各組兔造模側膝關節行關節腔注射，青藤堿組膝關節腔注射正清風痛寧注射液0.2 mL（5 mg），每3 d注射1次，共10次；透明質酸鈉組膝關節腔注射玻璃酸鈉注射液0.2 mL，每6 d注射1次，共5次；模型組膝關節腔注射生理鹽水0.2 mL，注射次數同青藤堿組。干預30 d。實驗過程中，模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組兔各死亡1只，各組實驗兔最終為空白組8只，其余3組各9只。

2.2 取材及標本處理

2.2.1 關節液采集 干預結束后，生理鹽水沖洗收集關節液。于兔右膝關節腔內注入生理鹽水1 mL，充分活動膝關節使生理鹽水與關節液充分混合，再抽取關節腔生理鹽水0.6～1 mL至EP管，4000 r/min離心10 min，取上清液，-80 ℃保存備檢。

2.2.2 滑膜采集 關節液標本采集完畢后，耳源靜脈空氣栓塞法處死全部實驗動物。采用髕旁內外并橫斷骸韌帶的聯合切口，將軟組織瓣包括髕骨一起向上翻起，并極度屈膝以充分顯露膝關節腔，肉眼觀察滑膜、軟骨等大體情況并記錄，取右膝髕骨下滑膜組織，以冰生理鹽水沖洗后置10％中性甲醛中固定48 h，石蠟包埋，常規切片備用。

2.3 軟骨血管內皮生長因子和神經生長因子表達檢測

干預結束后第2日，切取兔右膝內側脛骨平臺約5 mm厚帶有軟骨下骨質的軟骨組織，修成0.5 cm× 0.5 cm×0.3 cm，經蒸餾水沖洗后置于10％中性甲醛溶液固定48 h，乙二胺四乙酸脫鈣，石蠟包埋，5 μm連續切片，免疫組化檢測VEGF及NGF的表達，細胞內呈棕褐色為陽性結果，應用顯微圖像分析系統采集圖像。隨機選取3個視野，注意選取臨近退變缺損部位，對具有完整4層軟骨結構的區域進行觀測；計算每個視野內陽性細胞數和細胞總數，計算細胞分數（陽性細胞數÷細胞總數×100％），用百分比表示VEGF和NGF的表達量；每張切片細胞計數分別由3個獨立觀察者進行，其評分誤差率≤5％，取其均值。

2.4 滑膜血管內皮生長因子和神經生長因子表達檢測

取右膝髕骨下滑膜組織，經蒸餾水沖洗后置10％中性甲醛中固定48 h，石蠟包埋，常規切片，免疫組化檢測VEGF和NGF的表達，細胞漿被染成棕褐色及其受體高親和性受體TrkA和低親和性p75受體在正常關節軟骨細胞有少量表達[11-12]，而在OA軟骨的表達量顯著升高[13-14]。機械壓力、炎性刺激及內脂素均可誘導人、小鼠軟骨細胞表達NGF，構成OA關節痛的機制之一[15]。研究發現，OA患者關節液中NGF含量顯著升高[16]，且與軟骨退變程度密切相關[13-14]；關節腔注射NGF可增強OA大鼠痛性行為反應[17]。本實驗免疫組化檢測結果顯示，VEGF和NGF在正常兔軟骨及滑膜均有少量表達，在KOA兔軟骨及滑膜均呈高表達，與文獻報道一致；青藤堿關節腔注射可顯著降低KOA兔軟骨及滑膜中VEGF和NGF的表達量，效果優于玻璃酸鈉關節腔注射。血管生成是炎性反應尤其是慢性炎性反應的重要特征，本實驗結果顯示，青藤堿可下調促血管生成因子在KOA兔軟骨及滑膜中的表達，與本研究前期觀察到的青藤堿抑制KOA兔滑膜炎性反應是一致的，但具體是通過何種機制，涉及哪些信號通路尚未清楚，有待深入研究。OA關節內新生血管形成通常伴有感覺神經的生長，構成OA關節疼痛的重要因素。青藤堿緩解OA關節疼痛已得到臨床廣泛證實，本研究結果提示抑制關節內血管神經的生長可能是青藤堿減輕OA疼痛作用的一個重要機制。

[1]白玉龍,許紅英,楊曉冰.鹽酸青藤堿改善膝骨關節炎患者運動功能36例[J].中國臨床康復,2002,6(27)：3731-3735.

[2]鄭潔,王瑞輝,寇久社.青藤堿關節腔注射對兔膝骨關節炎模型組織形態學及基質金屬蛋白酶-13和軟骨寡聚基質蛋白的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2016,23(1)：74-77.

[3]BROWN R A, WEISS J B. Neovascularisation and its role in the osteoarticular process[J]. Ann Rheum Dis,1988,47(11)：881-885.

[4]FRANSES R E, MCWILLIAMS D F, MAPP P I, et al. Osteochondral angiogenesis and increased protease inhibitor expression in OA[J]. Osteoarthritis & Cartilage,2010,18(4)：563-571.

[5]BONNET C S, WALSH D A. Osteoarthritis, angiogenesis and inflammation[J]. Rheumatology (Oxford),2005,44(1)：7-16.

[6]ASHRAF S, WIBBERLEY H, MAPP P I, et al. Increased vascular penetration and nerve growth in the meniscus：a potential source of pain in osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis,2011,70(3)：523-529.

[7]MAPP P I, AVERY P S, MCWILLIAMS D F, et al. Angiogenesis in two animal models of osteoarthritis[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2008,16(1)：61-69.

[8]蘇偉,謝文,關明.骨性關節炎患者血管內皮生長因子的表達[J].檢驗醫學,2008,23(1)：42-45.

[9]邱波,陳宣銀,周建林.骨關節炎軟骨中血管內皮生長因子mRNA表達[J].武漢大學學報(醫學版),2011,32(1)：51-54.

[10]SUNITA S, GILL S E, SALLY MDC, et al. Neurovascular invasion at the osteochondral junction and in osteophytes in osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis,2007,66(11)：1423-1428.

[11]GIGANTE A, BEVILACQUA C, PAGNOTTA A, et al. Expression of NGF, Trka and p75 in human cartilage[J]. Eur J Histochem,2003,47(4)：339-344.

[12]GRIMSHOLM O, GUO Y, NY T, et al. Expression patterns of neurotrophins and neurotrophin receptors in articular chondrocytes and inflammatory infiltrates in knee joint arthritis[J]. Cells Tissues Organs,2008,188(3)：299-309.

[13]HUANG H, SHANK G, MA L, et al. Nerve growth factor induced after temporomandibular joint inflammation decelerates chondrocyte differentiation[J]. Oral Dis,2013,19(6)：604-610.

[14]IANNONE F, DE BARI C, DELL'ACCIO F, et al. Increased expression of nerve growth factor (NGF) and high affinity NGF receptor (p140 TrkA) in human osteoarticular chondrocytes[J]. Rheumatology (Oxford),2002,41(12)：1413-1418.

[15]PECCHI E, PRIAM S, GOSSET M, et al. Induction of nerve growth factor expression and release by mechanical and inflammatory stimuli in chondrocytes：possible involvement in osteoarthritis pain[J]. Arthritis Res Ther,2014,16(1)：R16.

[16]ALOE L, TUVERI MA, CARCASSI U, et al. Nerve growth factor in the synovial fluid of patients with chronic arthritis[J]. Arthritis Rheum,1992,35(3)：351-355.

[17]ASHRAF S, MAPP P I, BURSTON J, et al. Augmented pain behavioural responses to intra-articular injection of nerve growth factor in two animal models of osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis,2014,73(9)：1710-1718.

Effects of Sinomenine on Expressions of VEGF and NGF in Articular Cartilage and

Synovium of Rabbit Knee Osteoarthritis Models

ZHENG Jie1, WANG Rui-hui1, KOU Jiu-she2,

LUO Hao3(1. College of Acupuncture & Moxibustion, Shaanxi Universtiy of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China; 2. The Second Hospital Affiliated to Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China; 3. College of Medical Technology, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China)

Objective To observe the effects of intra-articular injection of sinomenine on the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and nerve growth factor (NGF) in articular cartilage and synovium of rabbit knee osteoarthritis models; To discuss its mechanism of action. Methods Totally 40 New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups: control group, model group, hyaluronate group and sinomenine group. Model group, hyaluronate group and sinomenine group established knee osteoarthritis model by using intra-articular injection of papain enzyme and were treated with saline, sodium hyaluronate and sinomenine respectively for 30 d, except for the control group. After treatment, method of immunohistochemistry was used to detect the expressions of VEGF and NGF in rabbit articular cartilage and synovium. Results Compared with the control group, the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium of model group significantly increased (P<0.01); compared with the model group, the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium of sinomenine group significantly decreased (P<0.05, P<0.01); the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium in sinomenine group were lower than hyaluronate group (P<0.05, P<0.01). Conclusion Intra-articular injection of sinomenine can down-regulate the expressions of VEGF and NGF in articular cartilage and synovium of rabbit knee osteoarthritis.

sinomenine; osteoarthritis; vascular endothelial growth factor; nerve growth factor; rabbits

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.011

R285.5

A

1005-5304(2016)03-0038-04

陜西省教育廳科學研究項目（14JK1209）；陜西省中醫康復學重點學科建設項目（2011年）；陜西中醫學院創新基金培育項目（14XJZR27）

（2015-06-30；編輯：華強）