殼聚糖絮凝法精制補腎養血顆粒水提液的工藝研究

杜艷嬌，康琛，杜茂波，沈碩，李曼玲，梁麗娜，劉淑芝

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫科學院眼科醫院，北京 100040

殼聚糖絮凝法精制補腎養血顆粒水提液的工藝研究

杜艷嬌1，2，康琛2，杜茂波2，沈碩2，李曼玲2，梁麗娜3，劉淑芝2

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫科學院眼科醫院，北京 100040

目的 優選殼聚糖精制補腎養血顆粒水提液的工藝。方法 以淫羊藿苷為指標，應用高效液相色譜法測定其含量，采用正交設計法考察加水量、提取時間、提取次數對水提工藝的影響；以淫羊藿苷為指標，結合總多糖含量，選擇藥液濃度、絮凝溫度、澄清劑加入量3個因素，優選殼聚糖的絮凝澄清條件。結果 最佳水提工藝條件為A2B1C3，即加入10倍量水，提取3次，每次1 h；最佳絮凝工藝為A1B2C3，即藥液濃度為0.4 g/mL，絮凝溫度為40 ℃，殼聚糖加入量為0.1%。結論 本研究優選的精制工藝穩定可行。

補腎養血顆粒；淫羊藿苷；殼聚糖；精制工藝；正交試驗

補腎養血顆粒由枸杞子、淫羊藿、當歸、黃芪、石斛等藥材組成，是中國中醫科學院眼科醫院莊曾淵研究員的臨床經驗方，具有補腎益精、養血明目功效，眼科臨床常用于治療視網膜色素變性、年齡相關性黃斑變性等疾病。殼聚糖是甲殼素N-脫乙酰基后的衍生物，性質穩定，具有良好的生物可降解性和相容性，毒性極小且來源廣泛，是自然界罕見的帶正電荷纖維結構化合物，不溶于水和堿溶液，但可溶于稀酸。利用殼聚糖的電荷和大分子架橋的作用，在中藥水提取液中加入一定量的殼聚糖，吸附和絮凝去除溶液中的不溶性顆粒和鞣質、蛋白質、樹脂等雜質，得到澄清的溶液，在中藥復方精制工藝中得到廣泛應用。與醇沉法相比，能耗小，成本低，能夠保留大部分多糖等有效成分，作為中藥水提液澄清劑具有良好的應用前景[1]。因此，本研究以淫羊藿苷含量為指標，優選補腎養血顆粒殼聚糖澄清法精制工藝。

1 儀器與試藥

Waters Alliance高效液相色譜儀（美國Waters公司），1515型檢測泵，2487型檢測器，717型自動進樣器；BP211D型十萬分之一電子天平，BSS210型萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；Agilent 8453E型紫外分光光度計；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；HJ-6型六聯磁力加熱攪拌器（金壇市萬華實驗儀器廠）。

淫羊藿苷對照品（批號0737-9508，中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用），無水葡萄糖（批號991122，北京化學試劑公司），苯酚（批號030805，北京化學試劑公司），乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，硫酸、乙醚均為分析純。處方藥材均購自安徽亳州芳益堂。殼聚糖為藥用級（批號20131012，北京鳳禮精求商貿有限責任公司），臨用前用1%醋酸加熱配成1%溶液[2]，放置24 h使其充分溶脹，備用。

2 方法與結果

2.1 淫羊藿苷含量測定

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水（28∶72）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長270 nm，柱溫35 ℃，理論板數按淫羊藿苷峰計算應不低于1500。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取提取物干膏粉約0.2 g，精密稱定，置塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，靜置，取上清液，過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例分別稱取除淫羊藿外的其余藥味，按提取精制工藝制成缺淫羊藿的陰性樣品，按“2.1.3”項下方法制成缺淫羊藿的陰性對照溶液。

2.1.5 線性關系考察 按“2.1.2”項下方法配制對照品溶液，按上述色譜條件，分別進樣2、4、6、10、15、20 μL，記錄淫羊藿苷峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y＝2.2×105X＋55 471（r＝0.999 7，n＝6），表明淫羊藿苷在0.2～2 μg與峰面積呈良好線性關系。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，每次10 μL，記錄淫羊藿苷峰面積，結果淫羊藿苷峰面積RSD＝1.73%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.1.3”項下制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別進樣20 μL，記錄淫羊藿苷峰的面積，結果淫羊藿苷平均含量為 1.218 mg/g原藥材，RSD＝0.58%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣20 μL，記錄淫羊藿苷的峰面積，結果淫羊藿苷峰面積RSD＝0.98%，表明淫羊藿苷在24 h內穩定性良好。

2.1.9 空白試驗 取陰性對照溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，進樣20 μL，記錄色譜圖（見圖1）。結果表明，在淫羊藿苷的保留時間處無色譜蜂，說明對測定無干擾。

圖1 補腎養血顆粒中淫羊藿苷HPLC圖

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品6份，各精密加入淫羊藿苷對照品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果見表1，表明本法具有良好的回收率。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗

2.2 總多糖含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取無水葡萄糖對照品25 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加適量水溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無水葡萄糖0.1 mg）。

2.2.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置具塞試管中，分別加水補至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40 ℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法[2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）附錄V A]，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y＝65.285X－0.052（r＝0.998 7），線性范圍2.475～14.85 mg/L。

2.2.3 測定法 取本品粗粉約0.5 g，精密沉定，加乙醚100 mL，加熱回流1 h，靜置，放冷，小心棄去乙醚液，殘渣連同濾紙置燒瓶中，加水150 mL，加熱回流2 h。趁熱過濾，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至250 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置具塞試管中，加水1.0 mL，按“2.2.2”項下方法，自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中葡萄糖質量，計算，即得。

2.3 水提工藝優化

根據浸提理論及查閱相關文獻[3-6]，影響水提工藝的因素主要有加水量、提取時間、提取次數等，故本試驗選取加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）3個因素進行考察。按L9（34）正交表進行試驗，按處方比例稱取9份枸杞子等水提藥材，每份共70 g，置圓底燒瓶中，加熱回流，過濾，濾液經水浴濃縮，真空干燥，得干膏，稱重，粉碎成干膏粉。以淫羊藿苷含量為考察指標，優選最佳水提工藝，因素水平見表2，試驗安排及結果見表3，方差分析見表4。

由直觀分析法可知，影響淫羊藿苷含量的主次順序為C＞B＞A，即提取次數＞提取時間＞加水量，其中C因素是最主要因素；經方差分析可知，A因素和B因素對提取工藝均無顯著影響（P＞0.05），C因素對提取工藝具有顯著影響（P＜0.05），故確定最佳工藝為A2B1C3，即加10倍量水，提取3次，每次1 h。

2.4 絮凝工藝優化

根據相關文獻[7-9]，影響殼聚糖純化效果的因素主要有藥液濃度、絮凝溫度、殼聚糖加入量、藥液的pH值、放置時間，絮凝攪拌速度等。本試驗選取藥液濃度（A）、絮凝溫度（B）、殼聚糖加入量（C）3個因素，每個因素考察3個水平。稱取處方藥材540 g，置10000 mL圓底燒瓶中，按優選出的最佳水提工藝條件進行提取，即加入5400 mL水，加熱回流提取3次，每次1 h，過180目篩，合并濾液，將濾液濃縮至一定濃度，離心，按正交試驗設計安排將藥液濃縮至0.4、0.2、0.1 g/mL的溶液，測定淫羊藿苷含量及總多糖含量。因素水平見表5，試驗安排及結果見表6，方差分析見表7、表8。

表2 水提工藝正交試驗因素水平表

表3 水提工藝正交試驗安排及直觀分析

表4 水提工藝方差分析

由直觀分析法可知，RA＞RB＝RC，影響淫羊藿苷含量的主次順序為A＞B＝C，即藥液濃度＞絮凝溫度＝殼聚糖加入量，其中A因素是最主要因素；經方差分析可知，A、B、C因素對絮凝工藝均無顯著影響（P＞0.05），故最佳工藝為A2B2C3，即藥液濃度為0.2 g/mL，絮凝溫度為40 ℃，殼聚糖加入量為0.1%。

表5 絮凝工藝正交試驗因素水平

表6 絮凝工藝正交試驗安排及直觀分析（mg/g原藥材）

表7 淫羊霍苷含量方差分析

表8 總多糖含量方差分析

由直觀分析可知，影響總多糖含量的主次順序為A＞B＞C，即藥液濃度＞絮凝溫度＞殼聚糖加入量，其中A因素是最主要因素；經方差分析可知，A因素對絮凝工藝有顯著影響（P＜0.05），故確定最佳工藝為A1B2C3，即浸膏濃度為0.4 g/mL，絮凝溫度為40 ℃，殼聚糖加入量為0.1%。

綜上分析，由于以淫羊藿苷為含量指標時，A因素對絮凝工藝無顯著影響（P＞0.05），而考察總多糖含量時，A因素對絮凝工藝有顯著影響（P＜0.05），故而最終確定最佳工藝為A1B2C3。

2.5 驗證試驗

按處方比例稱取180 g水提藥材，按最佳提取工藝提取，水提液平均分成3份，按優選的最佳絮凝工藝進行驗證試驗，結果見表9。說明該工藝穩定可行。

表9 驗證試驗結果

3 討論

本試驗在淫羊藿苷含量測定流動相選擇時，考察了乙腈-水（30∶70）和乙腈-水（28∶72）2種比例，結果發現，流動相為乙腈-水（30∶70）時，陰性對照在淫羊藿苷保留時間處有干擾，而流動相為乙腈-水（28∶72）時無干擾。

殼聚糖澄清劑法雖然具有諸多優點，但目前技術尚不成熟，在精制過程中或多或少會有殘留，雖然殼聚糖毒性低且具有良好的生物相容性，但其本身具有一定的藥理功效[10-11]，尚需進一步探討。中藥復方水提液體系復雜，殼聚糖對水提液中各成分的影響亦有待進一步研究。

[1] 張彤,徐蓮英,蔡貞貞.殼聚糖澄清劑精制中藥水提液的應用前景[J].中國中藥雜志,2001,26(8)：516-519.

[2] 宋信莉.殼聚糖澄清劑法精制天麻鉤藤飲工藝的研究[J].貴陽中醫學院學報,2013,35(3)：314-316.

[3] 李海濱,呂佳.正交設計考察益腎康顆粒劑提取工藝[J].中醫藥學刊, 2006,24(7)：1361-1362.

[4] 武海燕,洪筱坤,沈謙,等.正交實驗優選乳寧顆粒劑的水提與精制工藝[J].醫藥導報,2006,25(12)：1314-1316.

[5] 孔成福.正交實驗法優化淫黃顆粒的提取工藝[J].浙江中醫藥大學學報,2008,32(4)：528-529.

[6] 劉起華,文謹,孫玉雯.正交試驗法優選補腎益髓顆粒提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2010,16(9)：8-11.

[7] 韓樂，孫曉海，韓偉.殼聚糖絮凝法精制合歡皮多糖水提液的工藝[J].生物加工過程,2014,12(2)：38-43.

[8] 陳英,李永吉,程淑云,等.殼聚糖絮凝法精制紅花水提液工藝的研究[J].時珍國醫國藥,2007,18(5)：1167-1168.

[9] 王勇,鄒韻,李永輝.正交試驗優選裸花紫珠水提液的殼聚糖絮凝澄清工藝[J].海南醫學院學報,2015,21(1)：7-13.

[10] 唐大川,楊紅.殼聚糖神經保護機制研究進展[J].中華實驗眼科雜志, 2014,32(3)：281-284.

[11] 許劍峰.殼聚糖及其衍生物的藥理活性研究進展[J].海峽藥學, 2006,18(6)：13-15.

Study on Refining Water Extract of Bushen Yangxue Granules by Chitosan Flocculation

DU Yan-jiao1,2, KANG Chen2, DU Mao-bo2, SHEN Shuo2, LI Man-ling2, LIANG Li-na3, LIU Shu-zhi2
(1. Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China; 3. Eye Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100040, China)

Objective To optimize refinement of water extract from Bushen Yangxue Granules by chitosan flocculation. Methods According to the content of icariin detected by HPLC, the waters amount, extraction time and extraction times were evaluated by orthogonal design. The effects of the solution concentration, clarifying temperature and the amount of clarifying agent on the flocculation clarification processes were optimized with the content of icariin and polysaccharides. Results The optimum water extraction processes A2B1C3were follows: 10 times amount of water, three times extraction and 1 h for each extraction process. The optimized flocculation clarification processes A1B2C3were as follows: solution concentration was 0.4 g/mL, the clarifying temperature was 40 ℃ and the addition of chitosan was 0.1%. Conclusion The optimized refining process is stable and feasible.

Bushen Yangxue Granules; icariin; chitosan; refining process; orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.026

R283.5

A

1005-5304(2016)04-0098-04

2015-08-26）

（

2015-09-11；編輯：陳靜）

北京市中醫藥科技發展項目（JJ2013-67）

劉淑芝，E-mail：liushuzhi2004@sina.com；梁麗娜，E-mail：lianglina163@163.com