HPLC法測定延續接骨丸中芍藥苷的含量

孫承浩+譚無名

[摘要] 目的 應用HPLC法測定延續接骨丸中芍藥苷的含量。 方法 采用高效液相色譜法測定延續接骨丸中芍藥苷的含量。采用色譜柱：Agilent TC-C18（2）5 μm，250×4.6 mm，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速為1.0 mL/min，檢測波長230 nm，進樣量為5 μL。 結果 芍藥苷在0.02514～1.0056 μg范圍內，進樣量與峰面積線性關系良好（r=0.9997）；平均加樣回收率97.43%（RSD=0.79%）。 結論 應用HPLC法測定延續接骨丸中芍藥苷的含量操作簡便、結果準確、重現性好。

[關鍵詞] 延續接骨丸；牛黃；赤芍；芍藥苷；HPLC

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2016）27-0115-03

延續接骨丸為我市中醫院生產的醫院制劑，由當歸、紅花、川芎、延胡索、赤芍、乳香等15味中藥材經干燥，粉碎，過篩，混合，每100 g粉末加煉蜜80 g制成大蜜丸，具有活血散瘀，消腫止痛的作用，主要用于治療跌打損傷，青紫腫痛，閃腰岔氣，筋斷骨折，瘀血作痛。由于原來的醫院制劑標準中沒有含量測定項，本文參照《中國藥典》2015年版一部、四部，并查閱相關文獻[1-6]，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）定量檢測處方中赤芍的芍藥苷含量，專屬性強，精密度和重復性良好。采用該方法可進一步控制生產中赤芍投料，為延續接骨丸質量監管提供有力的參考依據，現報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

島津2010 CH-T型高效液相色譜儀（包括自動進樣器、柱溫箱、四元低壓泵、紫外檢測器等重要組成部分）；BP211-D電子天平。LabAlliance HS3120 超聲清洗器。

1.2 試劑

乙腈為色譜純，乙醇、磷酸為分析純，芍藥苷對照品（批號110736-201640，含量為95.2%）由中國食品藥品檢定研究院提供。延續接骨丸樣品由遼陽市中醫藥制劑室提供，批號分別為160324、160420、160526。

2 方法與結果

2.1色譜操作條件及系統適用性

采用色譜柱：Agilent TC-C18（2） 5 μm，250×4.6 mm，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），流速1.0 mL/min，波長230 nm，進樣量 5 μL，柱溫30℃；

2.2 溶液的制備

（1）樣品溶液配制：取樣品適量，剪碎，混勻，取樣品約3 g，精密稱量置于錐形瓶中，加入稀乙醇溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，將上述混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液（圖1）。（2）對照品溶液配制：取芍藥苷對照品約20 mg精密稱定，至100 mL容量瓶中，加稀乙醇適量溶解，取5 mL上述溶液至20 mL容量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度即得（圖2）。（3）陰性樣品溶液的制備 按工藝方法制備缺少赤芍的陰性樣品，并根據“（1）”方法制備（圖3）。

2.3 線性關系考察

精密稱取芍藥苷對照品25.14 mg置于50 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。精密量取對照品儲備溶液0.1、0.2、0.5、1、2、4 mL，分別置于10 mL量瓶中，加稀乙醇或甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖，以進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。回歸方程為：Y=12063.5X-19118，r=0.9997（n=6），表明芍藥苷在0.02514～1.0056 μg范圍內，線性關系良好。

2.4 精密度試驗

取50.28 μg/mL芍藥苷對照品溶液，進樣量為5 μL，連續測定5次，以峰面積計算，RSD為0.8%，說明儀器精密度良好[5，7-10]。

2.5重復性試驗

見表1。

2.6穩定性試驗

取樣品測定項下的供試品溶液在常溫條件下放置0、2、4、6 h后分別進樣測試，記錄色譜圖，按峰面積計算，RSD為0.81%，結果表明供試品在常溫條件下6 h內穩定性良好。見表2。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量（0.854 mg/g）的樣品6份，精密稱定，然后分別精密加入0.2618 mg/mL的對照品溶液5、10、15 mL，再分別精密加入稀乙醇45、40、35 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 KHz）30 min，冷卻至室溫，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。照樣品測定項下方法測定，見表3。

2.8耐用性試驗

分別采用3根不同商品規格的色譜柱，對同一批樣品按供試品溶液制備方法制備并且依給定測定條件測定含量。見表4。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本試驗分別對提取條件進行了下述研究：采用加熱回流、超聲波提取等方法對提取效率進行考察，實驗結果發現超聲提取法效率較高；提取溶劑考察了甲醇、稀乙醇溶液，結果發現，提取效果無明顯差異；考慮到試劑毒性問題，故選用稀乙醇作為提取溶劑；同時又對稀乙醇用量25 mL、50 mL、100 mL以及提取時間15 min、30 min、60 min進行了考察，最終采用稀乙醇溶液50 mL，超聲提取30 min作為提取條件。

3.2流動相的選擇

流動相考察了乙腈-水，乙腈-磷酸溶液兩種系統，結果發現乙腈-磷酸溶液系統分離較好，同時考察了磷酸的濃度0.05%、0.1%、0.2%對芍藥苷分離效果的影響，綜合考慮分離度及對液相色譜儀的保護，確定了正文中流動相條件。

綜上，采用HPLC法測定延續接骨丸中芍藥苷的含量方法操作簡便，結果可靠，重現性好，為醫院制劑延續接骨丸中赤芍質量的考察提供了參考方法，可作為該制劑的質量控制方法[12-17]。

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（收稿日期：2016-06-28）