脂肪酶TL IM/K2CO3催化Markovnikov加成反應研究

杜理華，楊文俊

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

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脂肪酶TL IM/K2CO3催化Markovnikov加成反應研究

杜理華，楊文俊

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

咪唑類化合物因其具有廣泛的生物活性在醫藥行業中占有重要的地位.實驗首次采用了一種脂肪酶lipase TL IM (Thermomyceslanuginosus)/K2CO3催化的咪唑類化合物與乙烯酯類化合物的Markovnikov加成反應新方法.系統研究了催化劑lipase TL IM /K2CO3、溶劑、底物結構、底物摩爾比、溫度及反應時間對Markovnikov加成反應的影響規律.實驗結果表明：咪唑類化合物與乙烯酯類化合物發生Markovnikov加成反應的最佳條件為脂肪酶lipase TL IM /K2CO3(K2CO3質量分數為4.5%)，底物摩爾比1∶6，溫度為50 ℃且反應時間為24 h，并在此條件下反應產率高達85%.

Markovnikov加成；咪唑類化合物；酶促反應；脂肪酶

咪唑類化合物是一類重要的雜環化合物，在天然產物、生物體、醫藥、農藥、有機發光材料及離子液體領域都有非常重要的作用[1-7].Markovnikov加成反應是形成C—C,C—N,C—O,C—X鍵的重要方法之一.但用化學法催化的Markovnikov加成反應存在反應條件較苛刻、環境污染且伴有副反應發生等缺陷，影響加成反應的產率和選擇性[8].因此，尋找一條高效、綠色的咪唑類化合物的Markovnikov加成反應新方法顯得尤為重要.

在研究咪唑類化合物的Markovnikov加成反應過程中，文獻中常用的合成咪唑類衍生物方法是利用酰化酶[9-11]、鹽離子液體([bmim]BF4)[12]以及磷酸鉀[13]作為催化劑來催化加成.雖然催化過程中可以得到相對較好的產率，但是酰化酶反應時間高達72 h，離子液體存在不穩定性等不足.因此，研究一種高效環保的咪唑類化合物的Markovnikov加成反應新技術成為廣大化學工作者研究的熱點.本實驗研究了一種脂肪酶TL IM/ K2CO3催化的咪唑類化合物(4-硝基咪唑，2-甲基-4-硝基咪唑)與乙烯酯類化合物(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯，己二酸乙烯酯)加成反應的新方法，反應時間為24h，產率最高可達85%.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

4-硝基咪唑(AR,國藥集團化學試劑)，2-甲基-4-硝基咪唑(AR,國藥集團化學試劑)，乙酸乙烯酯(AR，江蘇永華精細化學品有限公司)，月桂酸乙烯酯(AR，東京仁成工業株式會社)，棕櫚酸乙烯酯(AR，東京仁成工業株式會社)，己二酸二乙烯酯(AR，東京仁成工業株式會社)，DMSO (AR，無錫海碩生物公司)，硅膠薄板(G60，煙臺江友硅膠開發有限公司)，柱層析硅膠(300～400目，煙臺江友硅膠開發有限公司)， Lipozyme TL IM (Novo Nordisk)，玻璃點樣毛細管(華西醫科大學儀器廠)，碳酸鉀(99%，分析純，江蘇彤晟試劑有限公司)，其他主要試劑都為分析純.

1.2 實驗器材

電子天平(BS224，賽多利斯科學儀器廠)，數顯水浴恒溫振蕩器(SHA-C，金壇市江南儀器廠)，真空干燥箱(XMTD-8222，上海精宏實驗設備有限公司)，三用紫外分析儀(ZF-I,上海顧村電光儀器廠)，磁力攪拌器(85-1，杭州大衛科教儀器有限公司)，旋轉蒸發儀(RE-2000，上海亞榮生化儀器廠)，核磁共振儀NRM(AVANCEⅢ,瑞士Bruker公司，TMS內標)，高效液相色譜儀HPLC(依利特P230Ⅱ，大連依利特分析儀器有限公司)，傅立葉變換紅外分光光度計(Avater 370，美國熱電設備公司)，數字顯微熔點儀(控溫型，X-5，北京泰克儀器有限公司)，質譜儀(Agilent 6210 TOF，美國Agilent公司).

1.3 實驗方法

將0.25 mmol咪唑類化合物(4-硝基咪唑，2-甲基-4-硝基咪唑)和1.5 mmol的乙烯酯類(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯，己二酸二乙烯酯)完全溶解于5 mL的DMSO中，加入0.27 g TL IM 酶和0.075 mmol K2CO3(0.010 4 g)，放50 ℃恒溫振蕩箱中反應，轉速180～200 r/min，反應過程用TLC定性監測，展開劑為V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=3∶1.反應結束后，過濾酶并用冰水和乙酸乙酯萃取除去DMSO，減壓蒸餾乙酸乙酯，經柱層析分離提純后得到產物，再通過1H NMR，13C NMR，ESI-MS表征分析.其反應式為

2 實驗結果及討論

在研究脂肪酶TL IM/K2CO3催化的Markovnikov加成反應的過程中，為了促進加成反應的進行和抑制不必要副反應.系統地探討了酶源、溶劑、底物摩爾比、底物的結構、溫度及反應時間對咪唑類化合物的Markovnikov加成反應影響.實驗研究選擇以4-硝基咪唑與乙酸乙烯酯的反應為咪唑類化合物的Markovnikov加成反應的模型反應，以便于進行各種條件的優化.

2.1 催化劑中K2CO3的量對反應的影響

實驗利用脂肪酶TL IM和不同摩爾的K2CO3(0，0.038，0.075，0.113，0.15 mmol)協同作用，催化4-硝基咪唑與乙酸乙烯酯的Markovnikov加成反應，實驗結果如圖1所示.其中，不同摩爾的K2CO3占整個催化劑質量所對應的比例分別為0%，2.3%，4.5%，6.7%，8.7%，100%.由圖1中可發現：反應24 h后，在脂肪酶TL IM(K2CO3, 0 mmol)催化下，反應產率為75%，當反應完全由K2CO3催化時(脂肪酶TL IM, 0 mmol)，其產率為72%.當采用脂肪酶TL IM與K2CO3協同作用時，反應的產率可以得到明顯提高.實驗結果表明：當脂肪酶TL IM (K2CO3，0.075 mmol，質量分數為4.5%)情況下產率最高，可達到85%.

1—脂肪酶TL IM(0%)；2—脂肪酶TL IM與0.038 mmol K2CO3(2.3%)；3—脂肪酶TL IM與0.075 mmol K2CO3(4.5%)；4—脂肪酶TL IM與0.113 mmol K2CO3(6.7%)；5—脂肪酶TL IM與0.15 mmol K2CO3(8.7%)；6—0.075 mmol K2CO3(100%)圖1 催化劑中K2CO3的含量對Markovnikov加成反應的影響Fig.1 The influence of amount of K2CO3 in catalyst on the reaction

2.2 反應溶劑對Markovnikov加成影響

對于酶催化的有機合成反應，反應介質體系是酶催化反應中重要研究內容之一.在非水酶學中，反應溶劑的物理性質(主要為疏水常數)對反應起著重要的影響.本實驗我們將不同極性溶劑作為研究對象，如正己烷、吡啶、四氫呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)等，其反應結果如圖2所示.實驗結果顯示，4-硝基咪唑只有在DMF，DMSO才能夠完全溶解，且在DMSO中產率最高(85%).

圖2 反應溶劑對咪唑Markovnikov加成反應影響Fig.2 The influence of solvent on the reaction

2.3 底物結構對Markovnikov加成的影響

底物親核性強弱對不同的反應(如酯化、酯交換、酰胺化和內酯化等)都有很大的影響.例如在多元醇和糖的酯化過程中都是伯羥基發生反應，在羥基和氨基存在時，水解酶顯示優先催化酯化反應而不是酰化反應.所以研究底物對酶催化反應也很關鍵.試驗將4-硝基咪唑和2-甲基-4-硝基咪唑作為Markovnikov加成的供體，乙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯和己二酸二乙烯酯為受體，探究了底物結構對Markovnikov加成的影響.表1可以得出氮雜環上若帶有吸電子基團，如硝基取代基，則有利于Markovnikov加成反應的進行，若有給電子基團如甲基，則不利于Markovnikov加成反應，且空間位阻也會影響反應的進行.從表1可以看出：4-硝基咪唑和不同乙烯酯類化合物反應，乙烯酯的鏈長越長，反應的活性越低，且二酸二乙烯酯的反應活性比單脂肪酸乙烯酯高.

表1 底物結構對Markovnikov加成反應的影響1)

Table 1 The influence of substrate on Markovnikov addition %

注:1) 反應溶劑為DMSO，底物摩爾比為1∶6，50 ℃，在脂肪酶TL IM/ K2CO3催化下反應24 h.

2.4 底物摩爾比對反應影響

考察了4-硝基咪唑和乙酸乙烯酯的不同摩爾比對反應產率的影響.如圖3所示，當4-硝基咪唑與乙酸乙烯酯摩爾比從1∶1上升到1∶8時，底物的產率逐漸升高.底物摩爾比為1∶6時，反應產率最高，繼續增加乙酸乙烯酯的量，不但沒有進一步提高反應的產率，反而引起副反應的發生而影響目標產物產率，所以得出該方法的最佳底物比為1∶6.

圖3 底物摩爾比對4-硝基咪唑與乙酸乙烯酯的Markovnikov加成反應影響Fig.3 The influence of substrate ratio of 4-nitroimidazole and vinyl acetate on Markovnikov addition

2.5 反應溫度對Markovnikov加成反應的影響

反應溫度是影響酶促反應的一大重要因素.本實驗研究了40，45，50，55 ℃條件下反應的進行情況，實驗結果如圖4所示.研究發現產物產率隨溫度的升高而提高，當溫度到達50 ℃時，產率最高，可達85%，此時如果繼續升高反應溫度，反而會引起酶活的降低，目標產物產率會降低，所以該方法的最佳反應溫度為50 ℃.

圖4 溫度對Markovnikov加成反應的影響Fig.4 The influence of temperature on Markovnikov addition.

2.6 反應時間對咪唑Markovnikov加成反應的影響

4-硝基咪唑與乙酸乙烯酯在摩爾比為1∶6，溫度為50 ℃，溶劑為DMSO，脂肪酶TL IM/K2CO3催化下的搖床中進行加成反應.不同時間的試驗結果如圖5所示，可以發現反應在4～12 h時產率變化很大，而16 h之后該反應慢慢趨緩，產率在24 h時達到最大(85%)，在30 h時，產物產率卻為83%.因此，綜合實驗經濟和工業生產的角度，最佳反應時間選擇了24 h.

圖5 反應時間對加成反應的影響Fig.5 The influence of reaction time on the Markovnikov addition

3 部分產物的表征數據

3.1 4-硝基咪唑與乙酸乙烯酯加成反應

4-硝基咪唑和乙酸乙烯酯的反應式為

乙酸1-(4-硝基咪唑基)-乙酯(1):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.66 (s,1H,N=CHN),8.10(s,1H,NCH=C),6.77(q,1H,J=6.25 Hz, CH3CHO), 2.06 (s, 3H, COCH3),1.78 (d, 3H,J=6.25 Hz, CHCH3).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6):δ=169.78 (CO), 147.80 (C4),137.24 (C2),120.13 (C5),77.34 (CH3CHO),21.13 (COCH3),20.18 (CHCH3). ESI-MS:m/z=200(M+1).

3.2 4-硝基咪唑與月桂酸乙烯酯加成反應

4-硝基咪唑和月桂酸乙烯酯的反應式為

月桂酸1-(4-硝基咪唑基)-乙酯(2):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.65(s,1H,N=CHN),8.09(s,1H,NCH=C),6.80(q,1H,J=6.15 Hz, CH3CHO),2.32 (t,2H,J=7.30 Hz, COCH2CH2),1.78(d,3H,J=6.25 Hz,CH3CHO),1.48(m,2H,O=CCH2CH2),1.18(m,16H,(CH2)8CH3),0.84(t,3H,J=6.70 Hz,CH2CH3).13 C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ=171.78 (CO),147.40(C4),136.58(C2),119.31(C5),76.79(CH3CHO),33.25(O=CCH2),31.36(CH2CH2CH3),28.78((CH2)6CH2CH2CH3),24.13(COCH2CH2),22.04(CH2CH3),19.72(OCHCH3),13.88(CH2CH3).ESI-MS:m/z=340(M+1).

3.3 4-硝基咪唑與己二酸二乙烯酯加成反應

4-硝基咪唑和己二酸二乙烯酯的反應式為

己二酸乙烯基1-(4-硝基咪唑基)-乙酯(4):1H NMR(500 MHz, DMSO-d6):δ=8.65(s,1H,N=CHN),8.10(s,1H,NCH=C),7.20(m,1H,OCH=CH2),6.79(q,1H,J=6.19 Hz,CH3CHO),4.89,4.64(m,2H,CH=CH2),2.42～2.36(m,4H,O=CCH2),1.78(d,3H,J=6.20 Hz, CHCH3),1.53(t,4H,COCH2(CH2)2).13C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ=172.00,170.65(CO),147.80(C4),141.66(OCH=CH2),137.08(C2),119.94(C5),98.46(OCH=CH2),77.29(CH3CHO),33.19,33.02(COCH2CH2CH2CH2),23.76,23.70(COCH2CH2CH2CH2),20.15(CHCH3). ESI-MS:m/z=312(M+1).

3.4 2-甲基-4-硝基咪唑與乙酸乙烯酯加成反應

2-甲基-4-硝基咪唑和乙酸乙烯酯的反應式為

乙酸1-(2-甲基-4-硝基咪唑基)-乙酯(5):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.63(s,1H,NCH=C),6.77(q,1H,J= 6.10 Hz, CH3CHO),2.46(s,3H,N=CCH3),2.07(s,3H,O=CCH3),1.75(d,3H,J=6.20 Hz, CHCH3).13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δ=169.74 (CO),148.48 (C4),146.79 (C2),119.62 (C5),76.26 (CH3CHO),21.05 (COCH3),20.05 (CHCH3),13.48 (NCCH3). ESI-MS:m/z=214(M+1).

3.5 2-甲基-4-硝基咪唑與己二酸二乙烯酯加成反應

2-甲基-4-硝基咪唑和己二酸二乙烯酯的反應式為

己二酸乙烯基1-(2-甲基-4-硝基咪唑基)-乙酯(8):1H NMR (500 MHz, DMSO-d6):δ=8.62(s,1H,C=CHN),7.19(m,1H,OCH=CH2),6.69(q,1H,J=6.10 Hz,CH3CHO),4.88,4.64(m,2H,OCH=CH2),2.46(s,3H,N=CCH3),2.42～2.38(m,4H,COCH2CH2CH2CH2),1.74(d,3H,J=6.20 Hz, CHCH3),1.53-1.52 (m,4H,COCH2CH2CH2).13C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ=171.78,171.35(CO),147.32(C4),140.66(OCH=CH2),138.16(C2),119.64(C5),98.37(OCH=CH2),77.18(CH3CHO),33.08,32.97(COCH2CH2CH2CH2),23.66,23.57(COCH2CH2CH2CH2),20.07(CHCH3),13.26(NCCH3).ESI-MS:m/z=326(M+1).

4 結 論

本實驗首次給出了一種利用脂肪酶TL IM (Thermomyceslanuginosus)/K2CO3催化的咪唑類化合物(4-硝基咪唑，2-甲基-4-硝基咪唑)和乙烯酯類化合物(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯，己二酸二乙烯酯)的Markovnikov加成反應新方法.與已報道的方法相比，該方法首次采用經濟環保的脂肪酶TL IM做催化劑，反應綠色環保且后處理簡單，反應產率高.合成的8 個咪唑類衍生物分別通過柱層析分離方法得到，并且其結構均通過1H NMR，13C NMR，ESI-MS表征分析及驗證.

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(責任編輯：陳石平)

The Markovnikov addition catalyzed by lipase TL IM fromThermomyceslanuginosus/K2CO3

DU Lihua, YANG Wenjun

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Because of the widely biological actives, imidazole compounds play an important role in the pharmaceutical industry. The Markovnikov addition of imidazole derivatives and vinyl esters catalyzed by lipase TL IM fromThermomyceslanuginosus/K2CO3was first reported here. The influence of the amount of catalyzes, solvent, the structure of substrate, temperature and the reaction time were explored systematically. The performence of Markovnikov was better when it reacted for 24 h at 50 ℃ and was catalyzed by lipase TL IM /K2CO3(K2CO3∶TL IM /K2CO3, 4.5%, m/m) and the molar ratio of substrate was 1∶6. About 85% conversion can be finally obtained.

Markovnikov addition; imidazole compounds; enzymatic reaction; lipase

2016-03-22

國家自然科學基金資助項目(21306172)；國家948計劃資助項目(2014-4-29)；浙江省自然科學基金資助項目(LY17B020010)；浙江省公益農業計劃項目(2014C32094)

杜理華(1979—)，女，河南安陽人，副教授，碩士生導師，研究方向為藥物合成新技術，E-mail：orgdlh@zjut.edu.cn.

R944

A

1006-4303(2016)06-0649-05