P27和Stathmin在宮頸癌組織中的表達及其相互關系

馬海濃　方來福　劉敏杰.寧波市第二醫院婦科，浙江寧波5040；2.寧波市鄞州人民醫院病理科，浙江寧波5040；.寧波市鄞州人民醫院婦產科，浙江寧波5040

P27和Stathmin在宮頸癌組織中的表達及其相互關系

馬海濃1方來福2▲劉敏杰3
1.寧波市第二醫院婦科，浙江寧波315040；2.寧波市鄞州人民醫院病理科，浙江寧波315040；3.寧波市鄞州人民醫院婦產科，浙江寧波315040

目的探討宮頸癌組織中P27蛋白和Stathmin蛋白的表達及其相互關系。方法應用免疫組織化學方法檢測P27蛋白和Stathmin蛋白在40例正常宮頸組織、40例宮頸上皮內瘤變（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）組織和60例宮頸癌組織中的表達水平。結果P27蛋白在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中陽性表達率分別為87.5%、77.5%和50.0%，三組之間差異有統計學意義（χ2=17.732，P＜0.05），Stathmin蛋白在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌組織中陽性表達率分別為17.5%、52.5%和86.7%，三組之間差異有統計學意義（χ2=67.1，P＜0.05）。P27和Stathmin蛋白表達與患者的年齡無關（P＞0.05），P27和Stathmin蛋白的表達與宮頸癌的組織學分化程度、有無淋巴結轉移和臨床分期有明顯的相關性（P＜0.05）。宮頸癌中Stathmin蛋白表達與P27蛋白表達呈負相關（r=-1，P＜0.05）。結論P27蛋白和Stathmin蛋白檢測可作為宮頸癌診斷中的一組腫瘤標記物，Stathmin蛋白可通過抑制P27蛋白的表達，促進宮頸癌的發生發展。

Stathmin；P27；CIN；宮頸癌；免疫組化

在全球女性腫瘤中宮頸癌發病率占第二位、死亡率占第三位，在欠發達國家其發病率居第一位。2012年新報告的宮頸癌約527 600例，死亡265 700例，占女性新發癌癥病例的15%[1]。大部分早期宮頸癌可通過手術切除或放療達到臨床治愈，但比較晚期宮頸癌的臨床治療效果并不太理想。尋找并發現宮頸癌演變過程中相關的腫瘤敏感指標，對阻止宮頸癌癌前病變的繼續發展，并在臨床早期診斷、治療和預后判斷中都起到十分重要的指導意義。

P27蛋白屬于細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（CD-KI）家族的成員之一[2]，研究顯示P27蛋白的低表達與腫瘤的預后不良有關[3-4]。Stathmin是普遍存在于脊椎動物細胞中的一種高度保守的蛋白，大多定位于細胞漿中，該蛋白作為細胞信號轉導分子，在細胞的增殖、組織再生、分化及發育中起重要作用，特別在惡性腫瘤的發生、發展及決定表型方面均具有十分重要的作用及意義[2，5]。已有研究表明，Stathmin基因及其表達的產物是惡性腫瘤生物治療中的一個新熱點[6]。

1　資料與方法

1.1一般資料

收集本院2013年1月～2015年7月手術切除宮頸癌及宮頸活檢標本共140例，其中宮頸鱗狀細胞癌組織60例，按組織學分化程度分為：高分化24例、中分化20例和低分化16例；按FIGO臨床分期（2000年版）[7]分為：Ⅰ期31例、Ⅱ期25例和Ⅲ期4例；有淋巴結轉移22例和無淋巴結轉移38例。宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）組織40例：CINⅢ級組織14例、CINⅡ級組織13例和CINⅠ級組織13例。正常宮頸組織40例。所有宮頸癌患者術前均未接受化療或放療，年齡25～67歲，中位年齡50歲，平均（51.0±9.2）歲。所有病例的病理診斷數據均經證實，并附有一份完整的病理資料。

1.2試劑與方法

1.2.1主要儀器和試劑切片機型號：俫卡RM2235，烤片儀型號：上海躍進醫療器械有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱GZX-GF101-1-BS-Ⅱ，孵育箱型號：上海躍進醫療器械有限公司電熱恒溫鼓風干燥箱PYX-DHS-400-LBS-Ⅱ，熱修復儀器型號：富士寶IH-S193A。Stathmin抗體購自英國AbD Serotec公司，Batch NO：110213；免疫組織化學SP法試劑盒和P27抗體購自北京中杉生物技術有限公司，并提供操作步驟，中杉公司P27抗體批號：14620807，中杉公司即用型廣譜二抗批號：14G34D08。

1.2.2方法應用免疫組織化學SP法來檢測P27和Stathmin蛋白。實驗步驟：①用陽離子片撈取3μm石蠟切片65℃烤片過夜；②脫蠟、水化；③用3%H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min；④用PBS沖洗3道后EDTA pH=9.0抗原熱修復20 min；⑤PBS沖洗3道后羊血清工作液室溫下封閉10 min；⑥傾去血清加一抗室溫孵育1 h；⑦PBS沖洗3道后即用型廣譜二抗室溫孵育25 min；⑧PBS沖洗3道后用型DAB顯色液顯色10 min；⑨蘇木素復染、藍化、梯度酒精脫水、干燥、二甲苯透明和中性樹膠封片，具體操作過程嚴格按照說明進行。陰性對照用PBS代替一抗染色，陽性對照用預實驗染色陽性片進行，每個組織蠟塊的連續切片做一張HE染色，用于免疫組織化學陽性染色部位的定位分析和對照判定。

1.3結果判斷

結果參照許良中等[8]的免疫組織化學染色方法進行判斷，隨機選擇10個400倍視野，采用雙盲法綜合判斷組織切片中染色陽性的細胞著色強度和陽性細胞所占百分比兩項參數，在顯微鏡下半定量判定染色結果。全部組織染色切片都由兩位病理診斷醫生閱片2次，以確保染色判定結果的一致性。

1.3.1Stathmin蛋白染色（1）Stathmin蛋白染色主要定位于細胞漿上，評分標準如下[9]：腫瘤顯色深淺按：a.基本不著色，0分；b.色淡，1分；c.色中，2分；d.色深，3分。（2）陽性細胞百分率：①無著色，0分；②＜30%，為1分；③30%～60%，為2分；④＞60%，為3分。兩者相加得分0～2分為陰性（-）；3～4分為陽性（1+）；5～6分為強陽性（2+）。

1.3.2P27蛋白染色P27蛋白染色主要定位于細胞核上。評分標準如下[10]：（1）陽性細胞百分率：a.＜5%，0分；b.5%～25%，1分；c.25%～50%，2分；d.≥50%，3分。（2）腫瘤顯色深淺按：a.基本不著色，0分；b.色淡，1分；c.色中，2分；d.色深，3分。兩者相加得分0～2分為陰性（-）；3～4分為陽性（1+）；5～6分為強陽性（2+）。

1.4統計學處理

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗，Spearman等級相關進行相關性分析，采用雙側檢驗，檢驗水準為α= 0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1P27蛋白表達情況

P27蛋白在正常宮頸組織中弱陽性率20.0%（8/40），強陽性率67.5%（27/40）；在CIN組織中弱陽性率40.0%（16/40），強陽性率37.5%（15/40）；宮頸癌組織中弱陽性率28.3%（17/60），強陽性率21.7%（13/60），三組比較差異有統計學意義（χ2=17.732，P＜0.05），而CIN組與正常宮頸組比較，差異無統計學意義（χ2=1.385，P＞0.05）。見表1、圖1。

2.2P27蛋白與宮頸癌不同臨床病理特征的關系

由表2中可見P27蛋白在高分化宮頸癌組織的表達（18/24，75.00%）明顯高于中分化癌（9/20，45.00%）和低分化癌（3/16，18.75%）（χ2=15.283，P＜0.05）；在宮頸癌組織中無淋巴結轉移比例（25/38，65.80%）明顯高于有淋巴結轉移（5/22，22.70%）（χ2=13.079，P＜0.05）；在Ⅰ期宮頸癌（20/31，64.50%）的表達要明顯高于Ⅱ+Ⅲ期宮頸癌（10/29，34.50%）（χ2=11.446，P＜0.05）；而與宮頸癌患者的年齡無關（χ2=0.341，P＞0.05）。

表1　P27蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內瘤變（CIN）組織和宮頸癌中表達情況[n（%）]

圖1　P27蛋白在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸癌中表達情況（×100）

2.3Stathmin蛋白表達情況

Stathmin蛋白在宮頸癌組織弱陽性率28.3%（17/60），強陽性率58.3%（35/60）；CIN組織中弱陽性率42.5%（17/40），強陽性率10.0%（4/40）；正常宮頸組織中弱陽性率17.5%（7/40）。三組比較差異有統計學意義（χ2=67.100，P＜0.05），而CIN組與宮頸癌組組織比較，差異也有統計學意義（χ2=26.196，P＜0.05）。見表3、圖2。

2.4Stathmin蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

Stathmin蛋白強陽性比例和強度在低分化宮頸癌組織（15/16，93.8%）中明顯高于中分化癌（12/20，60.0%）和高分化癌（8/24，33.3%），差異顯著（χ2=15.051，P＜0.05）；在無淋巴結轉移宮頸癌（15/38，39.5%）中的強陽性表達明顯低于有淋巴結轉移宮頸癌（20/22，90.9%）（χ2=15.490，P＜0.05）；在Ⅰ期宮頸癌（11/31，35.5%）的強陽性表達明顯低于Ⅱ+Ⅲ期宮頸癌（24/29，82.8%）（χ2=14.042，P＜0.05）；而與宮頸癌患者的年齡無關（χ2=0.500，P＞0.05）。見表4。

表2　P27蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征的關系（n）

表3　Stathmin蛋白在宮頸癌組織中、宮頸上皮內瘤變（CIN）組織和正常宮頸組織中表達情況[n（%）]

表4　Stathmin蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

圖2　Stathmin蛋白在宮頸癌組織中、CIN組織和正常宮頸組織中表達情況（×100）

2.5P27和Stathmin蛋白在宮頸癌組織中的表達關系

P27與Stathmin蛋白表達呈負相關（r=-1，P＜0.05）。見表5。

表5　Stathmin和P27蛋白在宮頸癌組織中表達的相互關系（n）

3　討論

P27蛋白屬于細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制因子（CD-KI）家族的成員之一，是細胞周期中重要的負性調節因子，在最為關鍵的G1/S限制點發揮細胞周期調節作用，任何引起P27功能障礙和蛋白表達水平均可能給細胞周期的“制動”機制造成嚴重損害，導致正常細胞的異常增殖[11，12]。研究發現，P27蛋白在正常宮頸組織中都有較高的表達水平，隨著宮頸癌演變發展，在CIN組織和宮頸癌組織中的表達水平明顯下降；P27蛋白在宮頸癌組織中的表達水平與腫瘤的不同分化程度、有無淋巴結轉移和FIGO分期等臨床數據均高度相關（均P＜0.05），提示P27蛋白的減少可能直接參與了宮頸癌的發生和演變，高水平表達的P27蛋白對正常宮頸組織的異常增殖起抑制作用，低表達的P27失去了對細胞增殖的抑制作用，從而導致了宮頸癌的發生發展。

人Stathmin蛋白也稱原癌基因蛋白18（Oneogene protein18，OP18），由150個氨基酸構成，相對分子質量約為19×103，是廣泛存在于細胞漿中的一種高度保守的可溶性磷酸蛋白，在細胞周期的不同階段通過去磷酸化和磷酸化作用來控制細胞周期，調節細胞微管系統的動力學平衡及細胞的增殖、分化等生物學行為[13，14]，有研究顯示，在很多不同的人類腫瘤組織中Stathmin蛋白均高表達，如在白血病[15]、乳腺癌[16，17]、前列腺癌[18]、肺癌[19，20]、肝癌[21]和胃癌[22]等惡性腫瘤中均可檢測到Stathmin蛋白的高水平表達。本研究發現Stathmin在宮頸癌組織中的表達量明顯比CIN組織和正常宮頸組織高（P＜0.05）。Stathmin蛋白在宮頸癌組織中的表達水平與腫瘤的不同分化程度、有無淋巴結轉移和FIGO分期等臨床數據均高度相關（均P＜0.05），提示Stathmin蛋白表達水平與宮頸癌的發生發展密切相關，Stathmin蛋白水平越高，腫瘤分化程度越差，越易發生轉移。由于Stathmin蛋白對腫瘤的診斷和預后的判斷都有一定的價值，將來很有可能成為一個新的宮頸癌治療的靶基因和腫瘤標志物。

通過研究還發現，P27蛋白和Stathmin蛋白的表達之間呈明顯負相關（r=-1，P＜0.05）。Baldassarre等[23]研究證實，P27蛋白與Stathmin蛋白結合后，能抑制其微管解離活性及表達，從而降低肉瘤細胞的侵襲和運動等生物學行為。Wang等[24]在肝癌中亦研究發現P27蛋白通過阻止Stathmin蛋白與微管的分離和干擾細胞間期微管的功能來對其發揮負性調節作用，上調腫瘤細胞中的P27蛋白可以抑制Stathmin蛋白的表達，從而促進腫瘤細胞增殖與分裂能力。在宮頸癌演變發展過程中隨著P27蛋白表達的降低Stathmin蛋白的表達明顯增加，此結果與P27能負性調控Stathmin的觀點一致。

綜上所述，P27和Stathmin蛋白是宮頸癌演變過程中的一組重要的抑癌基因和癌基因，共同參與了宮頸癌的發生發展，并在其中發揮重要作用。未來P27蛋白和Stathmin蛋白有可能成為一組判斷宮頸癌惡性程度及侵襲轉移的重要生物學指標，為宮頸癌患者的治療和和預后判斷提供參考依據。

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Expression of P27 and Stathmin in cervical cancer tissues and their correlations

MA Hainong1FANG Laifu2LIU Minjie3
1.Department of Gynecology,Ningbo Second Hospital,Ningbo 315040,China；2.Department of Pathology,Ningbo Yinzhou People's Hospital,Ningbo 315040,China；3.Department of Gynecology and Obstetrics,Ningbo Yinzhou People's Hospital，Ningbo 315040,China

Objective To investigate the expression of P27 protein and Stathmin protein in cervical cancer tissues and their correlations.Methods Immunohistochemical method was used to detect the expression of P27 protein and Stathmin protein in 40 cases of normal cervical tissues,40 cases of cervical intraepithelial neoplasia（CIN）and 60 cases of cervical cancer tissues.Results The positive expression rates of P27 protein in normal cervical tissues，CIN tissues and cervical cancer tissues were 87.5%，77.5%and 50.0%respectively.There was significant difference among the three groups（χ2=17.732，P＜0.05）.The positive expression rates of Stathmin protein in normal cervical tissues，CIN tissues and cervical cancer tissues were 17.5%，52.5%and 86.7%respectively.There were significant differences among the three groups（χ2=67.1，P＜0.05）.The expression of P27 and Stathmin was not correlated with the age of patients（P＞0.05）. The expression of P27 and Stathmin was significantly correlated with histological differentiation of cervical cancer，lymph node metastasis or not and clinical staging（P＜0.05）.The expression of Stathmin protein was negatively correlated with the expression of P27 protein in cervical cancer（r=-1，P＜0.05）.Conclusion Detection of P27 protein and Stathmin protein can be used as a group of tumor markers in the diagnosis of cervical cancer,and Stathmin protein may promote the occurrence and development of cervical cancer by inhibiting the expression of P27 protein.

Stathmin；P27；CIN；Cervical cancer；Immunohistochemistry

R737.33

A

1673-9701（2016）29-0004-05

浙江省寧波市科技局科技惠民計劃項目（2015C 50015）；浙江省寧波市科技局自然科學基金（2013A610229）▲

（2016-06-21）