惡性淋巴瘤診斷中熒光原位雜交分析基因狀態的研究

沈小英 亓崠東 武鑫瑞 屈悅 張立英 張玉萍 許春偉 吳繼華☆

(1.解放軍306醫院病理科，北京 100101；2.大連大學附屬中山醫院腫瘤科，遼寧 大連 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京軍區總醫院病理科，北京 100700；5.山東省濰坊市人民醫院病理科，山東 濰坊 261041；6.軍事醫學科學院附屬醫院病理科，北京 100071)

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惡性淋巴瘤診斷中熒光原位雜交分析基因狀態的研究

沈小英1亓崠東2武鑫瑞1屈悅3張立英4張玉萍5許春偉6△吳繼華1☆

(1.解放軍306醫院病理科，北京 100101；2.大連大學附屬中山醫院腫瘤科，遼寧 大連 116001；3.北京新基永康基因科技有限公司，北京 100085；4.北京軍區總醫院病理科，北京 100700；5.山東省濰坊市人民醫院病理科，山東 濰坊 261041；6.軍事醫學科學院附屬醫院病理科，北京 100071)

目的 探討惡性淋巴瘤中基因重排的特點。方法 回顧性分析87例惡性淋巴瘤組織樣本，利用熒光原位雜交技術，分別檢測彌漫大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤中BCL-6、BCL-2、MALT1、CCND1、C-MYC和ALK基因重排。結果 彌漫大B細胞性淋巴瘤中BCL-6基因重排的陽性率為29.03%(9/31)，濾泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排的陽性率為61.11%(11/18)，黏膜相關淋巴組織淋巴瘤中MALT1基因重排的陽性率為47.37%(9/19)，套細胞淋巴瘤中CCND1基因重排的陽性率為88.88%(8/9)，Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排的陽性率為100%(2/2)和間變性大細胞淋巴瘤中ALK基因重排的陽性率為75.00%(6/8)。結論 基因重排對惡性淋巴瘤的診斷具有重要的實際價值。

淋巴瘤； BCL-6基因； BCL-2基因； MALT1基因； CCND1基因； C-MYC基因；ALK基因

惡性淋巴瘤作為淋巴系統的原發的惡性腫瘤，由于其具有高度異質性，因此其診斷一直是病理診斷的重點和難點[1]。目前惡性淋巴瘤的診斷根據WHO(2008版)造血和淋巴組織腫瘤分類需運用病理形態學、免疫組化、分子遺傳學和臨床特征四者有機結合來確診[2]。在病理形態學、免疫組化和臨床特征仍不能確診的病例，分子基因檢測顯得尤為重要。其中熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)為一種敏感性高的檢測方法。惡性淋巴瘤分子病理診斷中熒光原位雜交的探針分為融合探針和斷裂探針，一般融合探針用于融合伙伴較少的基因，如彌漫大B細胞淋巴瘤的BCL-2/IGH融合探針和套細胞淋巴瘤的CCND1/IGH融合探針，其特異性較高，而斷裂探針主要用于融合伙伴較多的基因，如濾泡性淋巴瘤的BCL-6斷裂探針、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的MALT1斷裂探針、Burkitt淋巴瘤的C-MYC斷裂探針和間變性大細胞淋巴瘤的ALK斷裂探針[3-5]。本文運用熒光原位雜交分析上述惡性淋巴瘤中的基因重排情況，探討熒光原位雜交在惡性淋巴瘤診斷中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 收集2013年1月至2015年12月間解放軍306醫院、大連大學附屬中山醫院、北京軍區總醫院和山東省濰坊市人民醫院送檢進行熒光原位雜交的惡性淋巴瘤標本87例，其中彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)31例，濾泡性淋巴瘤(FL)18例，黏膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)19例，套細胞淋巴瘤(MCL)9例，Burkitt淋巴瘤(BL)2例，間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)8例。

1.1.2 主要試劑 BCL-2/IgH融合探針、CCND1/IgH融合探針、BCL-6斷裂探針、C-MYC斷裂探針、MALT1斷裂探針和ALK斷裂探針及緩沖液均購自廣州安必平(LBP)醫藥科技有限公司。

1.2 方法 熒光原位雜交(FISH)檢測步驟：4 μm石蠟薄切片，74 ℃烤箱中15 min，環保脫蠟劑脫蠟，酒精脫水，蒸餾水高壓水煮放氣后4 min。37 ℃ 0.01N HCl的胃蛋白酶中水浴消化60 min，加4 μL探針，85 ℃變性5 min，42 ℃雜交16 h，室溫下2× SSC/0.1%NP-40溶液中洗滌，10 μL的DAPT復染。以反應性淋巴組織為正常對照，結果在熒光顯微鏡下觀察。以上過程從加探針開始需避光操作。熒光原位雜交(FISH)檢測判讀：(1)BCL-2/IGH融合探針：在正常細胞核中出現紅、綠信號各2個(2R2F)，存在t(14,18)易位的細胞中出現1個紅色、1個綠色信號和1個融合的黃色信號(1R1G1F)，或出現2個融合黃色信號(1R1G2F)。腫瘤細胞出現黃色信號>5%的確定為t(14,18)易位。(2)CCND1/IGH融合探針：在正常細胞核中出現紅、綠信號各2個(2R2F)，存在t(14,18)易位的細胞中出現1個紅色、1個綠色信號和1個融合的黃色信號(1R1G1F)，或出現2個融合黃色信號(1R1G2F)。腫瘤細胞出現黃色信號>15%的確定為t(11,14)易位。(3)BCL-6斷裂探針：正常細胞核中出現2個黃色信號(2F)。存在3q27重排時細胞中出現1個紅色、1個綠色信號的分離信號和1個黃色信號(1R1G1F)；腫瘤細胞中出現1個紅色、1個綠色分離信號>10%的確定為有3q27重排。(4)C-MYC斷裂探針：正常細胞核中出現2個黃色信號(2F)。存在8q24重排時細胞中出現1個紅色、1個綠色信號的分離信號和1個黃色信號(1R1G1F)。腫瘤細胞中出現1個紅色、1個綠色分離信號>15%的確定為有8q24重排。(5)MALT1斷裂探針：正常細胞核中出現2個黃色信號(2F)。存在18q21重排時細胞中出現1個紅色、1個綠色信號的分離信號和1個黃色信號(1R1G1F)。腫瘤細胞中出現1個紅色、1個綠色分離信號>10%的確定為有18q21重排；(6)ALK斷裂探針：正常細胞核中出現2個黃色信號(2F)。存在2p23重排時細胞中出現1個紅色、1個綠色信號的分離信號和1個黃色信號(1R1G1F)。腫瘤細胞中出現1個紅色、1個綠色分離信號>15%的確定為有2p23重排。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數據分析，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 熒光原位雜交的結果 彌漫大B細胞淋巴瘤中BCL-6基因重排陽性率為29.03%(9/31)，依據Hans模型[1]采用免疫組化方法標記CD10、BCL-6 和MUM1，將DLBCL分為生發中心細胞(Germinal center b-cell,GCB)[CD10+,BCL-6+/-,MUM1+/-或CD10-,BCL-6+,MUM1-]和非生發中心細胞(non-GCB)[CD10-,BCL-6+/-,MUM1+或CD10-,BCL-6-,MUM1-]起源，其中GCB起源占16.67%(2/12)，non-GCB起源占36.84%(7/19)(圖1)；濾泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排陽性率為61.11%(11/18)，分級方面其中5例Ⅰ級中BCL-2基因重排陽性率為22.22%(4/18)，6例Ⅱ級中BCL-2基因重排陽性率為22.22%(4/18)，Ⅲa級中BCL-2基因重排陽性率為11.11%(2/18)，Ⅲb級中BCL-2基因重排陽性率為5.56%(1/18)(圖2)；黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤中MALT1基因重排陽性率為47.37%(9/19)，其中10例胃腸道黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤中MALT1基因重排陽性率為31.58%(6/19)，9例非胃腸道黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤中MALT1基因重排陽性率為15.79%(3/19)(圖3)；套細胞淋巴瘤中CCND1基因重排陽性率為88.88%(8/9)，除1例CD5陰性，CyclinD1陽性樣本外CCND1/IGH融合探針檢測均為陽性(易位)(圖4)；Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排陽性率為100%(2/2)，且均為EBER原位雜交陰性(圖5)；間變性大細胞淋巴瘤中ALK基因重排陽性率為75.00%(6/8)，其中ALK蛋白陽性樣本均為陽性，ALK蛋白表達陰性樣本均為陰性(圖6)。

2.2 不同性別惡性淋巴瘤患者基因的狀態情況 BCL-6基因重排在18例彌漫大B細胞淋巴瘤男性患者中的陽性率為27.78%(5/18)，在13例女性患者中為30.77%(4/13)，差異無統計學意義(P=0.856)；BCL-2基因重排在11例濾泡性淋巴瘤男性患者中的陽性率為63.64%(7/11)，在7例女性患者中為57.14%(4/7)，差異無統計學意義(P=0.783)；MALT-1基因重排在10例黏膜相關性淋巴瘤男性患者中的陽性率為40.00%(4/10)，在9例女性患者中為55.56%(5/9)，差異無統計學意義(P=0.498)；CCND1基因重排在6例套細胞淋巴瘤男性患者中的陽性率為83.33%(5/6)，在3例女性患者中為100%(3/3)，差異無統計學意義(P=0.453)；C-MYC基因重排均為2例Burkitt淋巴瘤男性患者；ALK基因重排在5例間變性大細胞淋巴瘤男性患者中的陽性率為60.00%(3/5)，在3例女性患者中為100%(3/3)，差異無統計學意義(P=0.206)。

2.3 不同年齡群體惡性淋巴瘤患者基因的突變情況 BCL-6基因在3例青少年(<18歲)彌漫大B細胞淋巴瘤患者中的陽性率為33.33%%(1/3)，在5例年輕患者(18～44歲)中為20.00%(1/5)，在11例中年患者(45～59歲)中為27.27%(3/11)，在12例老年患者(60～90歲)中為33.33%(4/12)，差異無統計學意義(P=0.951)；BCL-2基因在3例年輕濾泡性淋巴瘤患者(18～44歲)中的陽性率為66.67%(2/3)，在9例中年患者(45～59歲)中為55.55%(5/9)，在6例老年患者(60～90歲)中為66.67%(4/6)，差異無統計學意義(P=0.890)；MALT1基因在2例年輕黏膜相關性淋巴瘤患者(18～44歲)中的陽性率為50.00%(1/2)，在7例中年患者(45～59歲)中為57.14%(4/7)，在10例老年患者(60～90歲)中為40.00%(4/10)，差異無統計學意義(P=0.782)；CCND1基因在3例中年患者(45～59歲)中為100%(3/3)，在6例老年患者(60～90歲)中為83.33%(5/6)，差異無統計學意義(P=0.453)；C-MYC基因重排在2例青少年Burkitt淋巴瘤患者(<18歲)中的陽性率為100%(2/2)；ALK基因重排在4例年輕間變性大細胞淋巴瘤患者(18～44歲)中的突變頻率為100%(4/4)，在1例中年患者(45～59歲)中為100%(1/1)，在3例老年患者(60～90歲)中為33.33%(1/3)，差異無統計學意義(P=0.153)。

3 討 論

惡性淋巴瘤作為常見腫瘤，近年來發病率和死亡率在全球范圍內明顯增加，其中發病率占惡性腫瘤的4%～5%，居第6位，死亡率占惡性腫瘤的3%～4%，居第9位[6]。國內惡性淋巴瘤發病率和病死率分別居所有惡性腫瘤的第11位和第7位[7]。惡性淋巴瘤可見于任何年齡組，好發于全身各處，但以原發淋巴結為多，結外發病以胃腸道為多[2,8]。惡性淋巴瘤由分化程度不同的淋巴細胞、組織細胞和網狀細胞組成，由于淋巴細胞的分類差異，以及與組織細胞和網狀細胞的比例、分布和分化程度的差異造成了惡性淋巴瘤組織學形態的多樣性，部分病例的診斷比較困難。免疫組織化學染色陽性對于鑒別惡性淋巴瘤各亞型以及與其他增殖性疾病有一定的幫助，不能總是有效地輔助診斷惡性淋巴瘤[9]。

研究[9-11]表明彌漫大B細胞淋巴瘤中BCL-6基因重排，濾泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排，黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤中MALT1基因重排，套細胞淋巴瘤中CCND1基因重排，Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排，間變性大細胞淋巴瘤中ALK基因重排這些遺傳學異常可以作為判斷惡性淋巴瘤亞型的重要依據。 FISH是利用熒光標記的核酸分子作為探針，經變性解鏈后，在適當條件下與細胞內互補的核酸分子雜交，從而檢測后者存在的情況以及數量、結構等變化的一種方法。運用FISH方法，彌漫大B細胞淋巴瘤中BCL-6基因重排陽性率為29.03%(9/31)，濾泡性淋巴瘤中BCL-2基因重排陽性率為61.11%(11/18)，黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤中MALT1基因重排陽性率為47.37%(9/19)，套細胞淋巴瘤中CCND1基因重排陽性率為88.88%(8/9)，Burkitt淋巴瘤中C-MYC基因重排陽性率為100%(2/2)，間變性大細胞淋巴瘤中ALK基因重排陽性率為75.00%(6/8)。因此，對于不典型或特殊的惡性淋巴瘤，運用FISH方法大部分能夠得到確診。

綜上所述，惡性淋巴瘤因為種類繁多、分類龐大，臨床病史、形態學及免疫組化結合遺傳學特征具有重要診斷價值。

(本文圖1～6見封三)

[1] Roman E,Smith AG.Epidemiology of lymphomas[J].Histopathology,2011,58(1):4-14.

[2] 吳永芳,許春偉,韓鴻雁,等.443例惡性淋巴瘤臨床病理特征分析[J].臨床與病理雜志,2015,35(7):1268-1275.

[3] Akagi T,Motegi M,Tamura A,et al.A novel gene,MALT1 at 18q21,is involved in t(11;18) (q21;q21) found in low-grade B-cell lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue[J].Oncogene,1999,18(42):5785-5794.

[4] Kramer MH,Hermans J,Wijburg E,et al.Clinical relevance of BCL2,BCL6,and MYC rearrangements in diffuse large B-cell lymphoma [J].Blood,2016,92(9):3152-3162.

[5] Rezuke WN,Abernathy EC,Tsongalis G J.Molecular diagnosis of B-and T-cell lymphomas:fundamental principles and clinical applications[J].Clin Chem,1997,43(10):1814-1823.

[6] Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[7] Chen W,Zheng R,Baade P D.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[8] Sergent F,Baron M,Le Cornec J B,et al.Malignant transformation of abdominal wall endometriosis:a new case report[J].J Gynecol Obstet Biol Reprod(Paris),2006,35(2):186-190.

[9] Hsi AC,Hurley MY,Lee SJ,et al.Diagnostic utility of SOX11 immunohistochemistry in differentiating cutaneous spread of mantle cell lymphoma from primary cutaneous B-cell lymphomas[J].J Cutan Pathol,2016,43(4):354-361.

[10] Schraders M,Jong D,Kluin P,et al.Lack of BCL-2 expression in follicular lymphoma may be caused by mutations in the BCL2 gene or by absence of the t(14;18) translocation[J].J Pathol,2005,205(3):329-335.

[11] Zhang L,Gao L,Liu G,et al.Primary Burkitt′s lymphoma of the thyroid without Epstein-Barr virus infection:A case report and literature review[J].Oncol Lett,2014,7(5):1519-1524.

Genetic status analysis of 87 cases in malignant lymphoma diagnosis fluorescence in situ hybridization

ShenXiaoying1,QiDongdong2,WuXinrui1,QuYue3,ZhangLiying4,ZhangYuping5,XuChunwei6,WuJihua1.

1.DepartmentofPathology, 306HospitalofPLA,Beijing100101，China. 2.DepartmentofOncology,ZhongshanHospital,DalianUniversity,Dalian116001，China. 3.BeijingXinjiYongkangGeneScienceandTechnologyCo.,Ltd.,Beijing100085，China. 4.DepartmentofPathology,TheMilitaryGeneralHospitalofBeijingPLA,Beijing100700，China. 5.DepartmentofPathology,ThePeople'sHospitalofWeifang,Weifang,Shandong261041，China. 6.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofAcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100071,China.

Objective To analyze the characteristics of gene rearrangement in malignant lymphoma. Methods A retrospective analysis of 87 cases of samples with malignant lymphoma, which were used to detect gene rearrangement by fluorescence in situ hybridization, and Subtypes of diffuse large B cell lymphoma with the BCL-6 gene rearrangement, follicular lymphoma with the BCL-2 gene rearrangement, the mucosa associated lymphoid tissue lymphoma with MALT1 gene rearrangement, mantle cell lymphoma with CCND1 gene rearrangement, Burkitt lymphoma with C-MYC gene rearrangement and anaplastic large cell lymphoma with ALK gene rearrangement, respectively. Results The positive rate of BCL-6 gene rearrangement was 29.03% (9/31) in diffuse large B cell lymphoma, the positive rate of BCL-2 gene rearrangement was 61.11% (11/18) in follicular lymphoma, the positive rate of MALT1 gene rearrangement was 47.37% (9/19) in mucosa associated lymphoid tissue lymphoma, the positive rate of CCND1 gene rearrangement was 88.88% (8/9) in mantle cell lymphoma, the positive rate of C-MYC gene rearrangement was 100% (2/2) in Burkitt lymphoma and the positive rate of ALK gene rearrangement was 75.00% (6/8) in anaplastic large cell lymphoma. Conclusion Gene rearrangement has an important practical value to the diagnosis of malignant lymphoma.

Lymphoma； BCL-6 gene； BCL-2 gene； MALT1 gene； CCND1 gene； C-MYC gene； ALK gene

R733.1

A

1000-744X(2016)11-1126-03

2016-04-18)

△☆通信作者，△E-mail：xuchunweibbb@163.com；☆E-mail：jh_02821@126.com