線性探針技術在貴州地區(qū)耐藥結(jié)核病診斷中的應用價值

鄭雯琳 張銘 袁薇 陳依江

(貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004)

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線性探針技術在貴州地區(qū)耐藥結(jié)核病診斷中的應用價值

鄭雯琳 張銘 袁薇 陳依江

(貴州省疾病預防控制中心，貴州 貴陽 550004)

結(jié)核分枝桿菌； 線性探針； 耐藥性

結(jié)核病是全球嚴重的公共衛(wèi)生問題之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告[1]，每年有約145萬人死于該病。我國近年來結(jié)核病的發(fā)病率也日趨上升，現(xiàn)已有結(jié)核病人450萬例，且每年病死13萬例。其中耐多藥結(jié)核病是我國現(xiàn)階段結(jié)核病防控工作面臨的最大挑戰(zhàn)之一[2]。為了進一步推進耐多藥結(jié)核病防治工作，近年來我國已經(jīng)開始引進耐藥結(jié)核分枝桿菌分子生物學快速檢測技術以代替耗時的需借助于培養(yǎng)基的常規(guī)檢測方法。本研究對貴州本地200例分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌菌株進行檢測，與傳統(tǒng)比例法結(jié)果進行對比，探討該方法針對貴州地區(qū)的耐藥結(jié)核分枝桿菌的應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 貴州羅甸200株痰培養(yǎng)陽性菌株。

1.2 研究方法

1.2.1 傳統(tǒng)藥物敏感性試驗 利用傳統(tǒng)藥物敏感試驗檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼兩種一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，作為診斷試驗的金標準。

1.2.2 線性探針技術提取DNA 取500 μL處理后痰標本加入1.5 mL離心管內(nèi)，10 000×g 離心15 min；棄上清，加入500 μL去離子水，渦旋震蕩重懸沉淀物。10 000×g離心15 min；95 ℃水浴中孵育20 min；超聲裂解15 min。12 000×g 離心10 min，取5 μL上清液用于PCR檢測。

1.2.3 擴增 采用德國Hain LifescienceGmbH 公司生產(chǎn)的GenoType MTBDRplus試劑盒在PCR儀上對結(jié)核桿菌DNA 模板進行擴增。擴增體系：35 μL PNM，5 μL 10×buffer，0.2 μL DNA聚合酶，2 μL MgCl2溶液，2.8 μL ddH2O，5 μL DNA模板，最終容積達到50 μL。擴增條件：95 ℃，15 min;(95 ℃，30 s，58 ℃，2 min)，10個循環(huán)；(95 ℃，25 s，53 ℃，40 s，70 ℃，40 s)，30個循環(huán)；70 ℃，8 min，4 ℃，1 h。

1.2.4 雜交 將PCR 擴增產(chǎn)物和變性裂解液(DEN)各20 μL混勻加入雜交反應板，孵育5 min,然后加入雜交緩沖液(HYB)1 mL，混勻，將標記好的探針試條加入槽中，在雜交儀上45 ℃孵育30 min后將雜交液徹底吸出，再加入1 mL嚴格漂洗液(STR)，45 ℃雜交儀孵育15 min。在每個槽中加入1 mL按1∶100稀釋的標志物，雜交儀振動平臺上孵育30 min。再向每個槽中1∶100稀釋的底物并靜止避光孵育5～10 min。將試條取出置于吸水紙上干燥，然后粘貼在判讀表上。

1.3 結(jié)果判讀 線性雜交技術結(jié)果試紙條共有27 個反應條帶，分為4個區(qū)域，第一區(qū)為對照質(zhì)控帶，其他區(qū)為耐藥相關基因探針區(qū)，其中第二區(qū)是利福平耐藥相關rpoB 基因探針區(qū)，第三和第四區(qū)分別為異煙肼耐藥相關的KatG、inhA 基因探針區(qū)，當野生條帶均顯色而突變條帶無顯色時為藥物敏感，野生條帶缺失、突變條帶顯色或不顯色均為耐藥。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，檢測結(jié)果的真實性采用敏感度和特異度對其進行評價，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 比例法藥敏結(jié)果 利福平耐藥27例，利福平敏感173例，異煙肼耐藥18例，異煙肼敏感182例。

2.2 線性探針技術結(jié)果 利福平耐藥27例，利福平敏感173例，異煙肼耐藥18例，異煙肼敏感182例。

2.3 兩種方法比較 兩種方法對利福平檢測結(jié)果一致的有200例，兩種方法均為耐藥的27例，均為敏感的173例; 兩種方法對異煙肼檢測結(jié)果一致的有200例，兩種方法均為耐藥的18例，均為敏感的182例。線性探針GenoType MTBDRplus方法檢測利福平耐藥的靈敏度為100%，特異度為100%，陽性預測值為1，陰性預測值為1 ; 檢測異煙肼的靈敏度為100%，特異度為100%，陽性預測值為 1 ，陰性預測值為1 。線性探針技術技術與傳統(tǒng)藥敏實驗檢測所得利福平耐藥結(jié)核病發(fā)生率、異煙肼耐藥結(jié)核病發(fā)生率和耐多藥結(jié)核病發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 基因突變頻率分布 對GenoType MTBDRplus 檢測耐利福平及耐異煙肼的突變位點進行了分析，耐利福平基因突變頻率最高的是S531L(66.7%)，耐異煙肼基因突變頻率最高的為 S315T1(88.9%)。見表1。

表1 線性探針技術檢測利福平和異煙肼耐藥基因的突變頻率分布

3 討 論

線性探針雜交技術檢測作為分子診斷，其原理是基于對基因序列的分析而進行的結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性診斷。實驗方法與傳統(tǒng)的藥物敏感性實驗相比簡單，且檢測速度較快，目前已在很多國家使用。但有研究顯示，耐藥水平的高低會影響HAIN技術的檢測效果[3]。WHO 2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》對藥敏試驗進行了更新，指出藥敏試驗包括了表型藥敏試驗(即傳統(tǒng)藥敏試驗) 和基因型藥敏試驗; 結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥定義為表型或基因型藥敏試驗發(fā)現(xiàn)利福平耐藥[4]。說明分子檢測對耐藥結(jié)核病診斷的重要性，意味著一旦發(fā)現(xiàn)利福平基因型耐藥，就需要考慮其為耐藥結(jié)核的可能性[5]。

本研究中，GenoType MTBDR plus 檢測利福平耐藥的靈敏度達100%，與此前國外的研究結(jié)果一致[6-7]。已有研究顯示利福平耐藥由編碼RNA聚合酶β亞單位的rpoB 基因核心區(qū)的基因突變引起。本研究檢測利福平耐藥表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。由于不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐利福平的基因突變位點突變頻率均不同，本研究顯示，耐利福平基因突變頻率最高的是rpoB S531L,故提示貴州地區(qū)利福平耐藥主要以rpoB S531L 為主。異煙肼耐藥主要與katG 和inhA 基因有關，katG 基因突變與高水平耐藥相關， inhA 耐藥與低水平耐藥相關。本研究顯示，異煙肼耐藥主要基因突變?yōu)閗atG S315T1，提示貴州地區(qū)88.9%的耐異煙肼病例為高水平耐藥。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2011[R]. Geneva: World Health Organization, 2011.

[2] 衛(wèi)生部．全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告(2007-2008年)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2010．

[3] World Health Organization. Compannion handbook to the WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tubercuosis[R]. Geneva: World Health Organization, 2014．

[4] 段鴻飛. WHO 2014 年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊》解讀之六[J]. 中國防癆雜志,2015,37(6):658-659．

[5] Causse M, Ruiz P, Gutierrez JB,et al.Evaluation of new Geno-Type MTBDRplus for detection of resistance in cultures and direct specimens of Mycobacterium tuberculosis [J].Int J Tuberc Lung Dis,2008,12(12):1456-1460．

[6] Lacoma A, Garcia-Sierra N, Prat C, et al. GenoType MTBDRplus assay for molecular detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis strains and clinical samples [J]. J Clin Microbiol,2008,46(11):3660-3667．

[7] Miotto P, Piana F, Cirillo DM, et al.Genotype MTBDRplus: a further step toward rapid identification of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis [J]. J Clin Microbiol, 2008,46(1):393-394．

貴州省疾病預防控制中心基金項目(2015-E2-4)

R52

B

1000-744X(2016)11-1214-02

2016-06-08)