慢性疼痛對孕鼠及其子代抑郁行為的影響

李麗，陳翠，黃悅，譚迎春，周芳

(1.徐州醫科大學 護理學院，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫科大學附屬醫院 ICU，江蘇 徐州 221002)

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·論 著·

慢性疼痛對孕鼠及其子代抑郁行為的影響

李麗1，陳翠2，黃悅1，譚迎春1，周芳1

(1.徐州醫科大學 護理學院，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫科大學附屬醫院 ICU，江蘇 徐州 221002)

目的:構建孕鼠慢性疼痛動物模型，觀測慢性疼痛對孕鼠及其子代抑郁行為的影響。方法：將交配成功的母鼠隨機分為正常對照組、假手術對照組和慢性疼痛組(n=10)。慢性疼痛組母鼠足跖關節皮內注射無菌完全弗氏佐劑100 μl[500μg·(100μl)-1] 誘導產生關節炎痛，疼痛可覆蓋母鼠整個孕期(22d左右)及產后1周。用糖水消耗實驗、曠場實驗在不同時間點分別檢測母鼠及子鼠的抑郁行為表現。結果:(1) 母鼠：在造模后第12、18天及產后第6天，糖水實驗中慢性疼痛組小鼠糖水偏好度與假手術對照組比較均顯著降低(P<0.01)，曠場實驗中慢性疼痛組小鼠直立次數和中央區活動距離與假手術對照組比較均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，余時間點3組各指標相比差異無統計學意義(P>0.05)。(2) 子鼠：慢性疼痛組子鼠在出生后3周時其糖水偏好度、直立次數、中央區活動距離均低于假手術對照組(P<0.05或P<0.01)，在出生后6周時其糖水偏好度及直立次數低于假手術對照組(P<0.05或P<0.01)，余時間點3組各指標相比差異無統計學意義(P>0.05)。結論：慢性疼痛對孕鼠及其子代的抑郁行為有促發作用。

慢性疼痛； 孕鼠； 子鼠； 抑郁

疼痛是危害人類健康和嚴重影響人們的生活質量的常見臨床病癥。持續或間歇性地持續3個月以上的疼痛被稱為慢性疼痛[1]，其在普通人群中的發生率為20%～45%[2]。抑郁癥是另一個嚴重影響人們生活質量的常見疾病，目前我國抑郁癥的發生率在5%～15%，且呈迅速上升趨勢[3- 5]，在美國等西方發達國家抑郁癥的發生率高達17.1%[6]。流行病學研究顯示，抑郁人群的疼痛發生率和疼痛人群中抑郁的發生率均高于各自單純疾病。慢性疼痛病人中抑郁癥的發生率高達30%～54%[7]。抑郁癥病人中慢性疼痛患病率為15%～92%[8]，大多數就診的抑郁癥患者都訴有長期存在的頭痛、肌肉關節痛、腹痛等癥狀[9]。在成年雄性小鼠神經病理性疼痛模型及慢性炎癥性疼痛模型中，小鼠顯示出明顯的抑郁樣行為[10]。而有抑郁癥狀的小鼠，其痛閾值有顯著下降現象[11]。這些研究結果均提示，疼痛和抑郁是密切聯系、相互影響的。

本課題組前期研究發現，社會生活中的特殊群體妊娠期婦女如罹患慢性疼痛會出現焦慮、抑郁等不良情緒[12]。長期處于慢性疼痛與負性情緒的狀態下，其子代健康也恐遭受不利影響。而目前學術界對此部分的研究少見報道。因此，本研究通過構建孕期小鼠慢性炎癥性疼痛模型，觀測慢性疼痛對孕鼠及其子鼠抑郁行為的影響，以揭示孕期慢性疼痛的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

選用未受孕過的雌性小鼠，65～80日齡，33～35g，同批交配，交配用成年雄性小鼠，25～45g，實驗所用動物均為SPF級昆明小鼠，由徐州醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號[SYXK(Jiangsu) 2002- 0038]，10～12h后發現陰栓或陰道涂片發現精蟲者定為妊娠第 0天。選取30只成功受孕小鼠，隨機分為正常對照組、假手術對照組、慢性疼痛組3組，每組10只。子鼠出生后剔除死胎、發育畸形、先天殘疾小鼠后對其進行編號，用隨機數表法分別選出正常組子鼠、假手術組子鼠和慢性疼痛組子鼠各10只。所有小鼠均按常規方式飼養。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠慢性疼痛模型的制備

慢性關節炎疼痛模型:母鼠交配成功后當日(妊娠第0天)，在異氟醚麻醉下，圍繞左后足足跖關節部選擇兩點皮內注射無菌完全弗氏佐劑[complete Freund’s adjuvant，CFA，500μg·(100μl)-1]100μl，誘導產生關節炎。在注射后的24 h(妊娠第1天，即疼痛造模第1天)即出現熱和機械痛覺閾值的降低并可維持4周以上，覆蓋母鼠整個孕期(22d左右)及產后1周。

假手術對照組母鼠用同樣麻醉方式、同樣注射方法、同樣注射部位注入同體積無菌PBS。

1.2.2 孕鼠及其子鼠抑郁行為監測

孕鼠在造模后6、12、18d(如當日母鼠出現早產征兆則不測)及產后6d監測其抑郁行為狀況。子鼠分別于出生后3周(幼年期，可離乳獨立生活)、6周(青春期)、9周(成熟期)監測其抑郁行為狀況。因本研究所用動物為孕鼠，為避免抑郁行為監測方法對其機體造成較大刺激而誘發早產、流產、難產、死胎等傷害，故選擇對動物生理影響較小的曠場實驗和糖水實驗來監測。

1.2.2.1 糖水實驗 糖水實驗正式開始前先進行適應性實驗1周:小鼠單只單籠飼養，每籠配有自來水和1%糖水的飲水瓶各一，兩水瓶擺放位置、高度均一致，每隔12h將兩飲水瓶的位置互換1次。適應實驗1周 后，分別向每瓶加入足量的糖水或自來水并稱量各瓶質量做好記錄，24h后再次稱量糖水和自來水質量，計算每只小鼠糖水偏好度，即小鼠24h消耗的糖水量占總水量(糖水量+自來水量)的百分比。

1.2.2.2 曠場實驗 將小鼠置于高50cm、邊長100cm、底面平均分成25個小格(20 cm×20cm)、周邊和底面均為黑色的方形曠場分析箱中，自然光照，室內隔音。沿墻格為外周區域，其余為中央區域。每次實驗時捏住小鼠尾巴距根部2/3處輕放入分析箱正中格中，顯示器中觀察其5 min內活動情況，每次觀測結束后將小鼠排泄物清理干凈，每只僅測定1次。實驗結束錄像分析，軟件統計。選取中央活動路程和直立次數(兩前肢離地1cm以上)2個指標來判斷動物是否出現抑郁樣行為。

1.3 統計學處理

用GraphPad Prism 5.0軟件(GraphPad Software，USA)進行統計學分析并生成統計圖表。計量資料以均數±標準差表示，計數資料用百分比表示。各組行為學結果采用雙因素方差分析(two- way ANOVA，時間為組內因素，處理為組間因素)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 慢性疼痛對母鼠抑郁行為的影響

CFA造模后24h慢性疼痛組小鼠熱縮潛伏期與對照組相比顯著下降，提示造模成功。對3組動物均進行糖水實驗和曠場實驗。在糖水實驗中，3組動物在造模后第6天糖水偏好度無差異(P>0.05);在造模后第12天、第18天、產后第6天，慢性疼痛組小鼠糖水偏好度與假手術對照組比較均顯著降低(P<0.01)，見圖1A。曠場實驗中，3組動物在造模后第6天直立次數和中央區活動距離均無差異(P>0.05);在造模后第12天、第18天、產后第6天，慢性疼痛組小鼠直立次數和中央區活動距離與假手術對照組比較均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，見圖1B、C。

2.2 慢性疼痛對子鼠抑郁行為的影響

在糖水實驗中，慢性疼痛組子鼠在出生后3、6周時，其糖水偏好度與假手術對照組比較明顯降低(P<0.05)，出生9周時3組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2A。在曠場實驗中，慢性疼痛組子鼠在出生后3、6周時，其直立次數與假手術對照組比較顯著減少(P<0.05或P<0.01)，至出生后9周時3組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2B。慢性疼痛組子鼠在出生后3周，其中央區活動距離與假手術對照組相比明顯縮短(P<0.05)，出生6周后3組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2C。

3 討 論

慢性疼痛的長期折磨會導致抑郁的發生。其機制可能是慢性疼痛引起外周和中樞的炎癥級聯反應，導致巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞的促炎細胞因子(pro- inflamma torycytokines，PICs)釋放，激活氧化/硝化應激(oxidative and nitrosative stress，O&NS)通路，誘導下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo- pituitary- adrenocorticative and nitrosative stress，O&NS)通路，誘導下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo- pituitary- adrenocortical，HPA) 軸亢進，減少5- HT的釋放，從而導致抑郁[13]。從外在表現來看，人類抑郁的表現主要為生活興趣丟失，動物抑郁的表現為探索性活動減少及快感缺失。快感缺失是指對獎賞自身及獎賞水平變化的敏感性降低[14]。甜味溶液對嚙齒類動物是一種有效的獎賞。通常采用糖水消耗量或糖水偏好系數來評價動物快感缺失的程度。大多數學者認為糖水偏好系數降低是動物抑郁的核心癥狀[15]。本研究糖水實驗中，慢性疼痛組孕鼠糖水偏好度與對照組相比顯著下降，提示其快感缺失，出現抑郁癥狀。曠場實驗中，中央區活動路程和直立次數可以反映動物的探索性行為，這也是動物抑郁情緒的重要指標[16]。本研究中慢性疼痛組孕鼠這兩個指標均顯著低于假手術對照組。據此可認為慢性疼痛導致了孕鼠的抑郁情緒出現。不管是人類還是動物，孕產期母體荷爾蒙水平波動均較大，且這種變化與抑郁的發生密切相關[17- 18]，故本實驗選擇了母鼠孕早期(孕6d，即疼痛造模第6天)、中期(孕12d，即疼痛造模第12天)、晚期(孕18d，即疼痛造模第18天)及產后早期(產后6d)這幾個時間點，分別對其進行抑郁行為學檢測。結果顯示不同時間點慢性疼痛孕鼠的各抑郁行為數據之間差異并無統計學意義，這可能跟本實驗樣本量不夠大有關，我們將在以后的研究中予以補充。

與假手術對照組比較，aP<0.01，bP<0.05

圖1 慢性疼痛對孕鼠抑郁行為的影響

與假手術對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖2 孕期慢性疼痛對子鼠抑郁行為的影響

此外，孕期有抑郁癥狀的母體，其子代的健康狀況也會受到影響。人類母親抑郁的嬰兒會體驗更多的負性情緒而表現出更高的情緒性，青少年表現為煩躁不安，擁有較少的快樂體驗[19]。動物母體抑郁，子代會出現焦慮、抑郁和行為退縮[15]。本實驗中慢性疼痛組的子鼠在其幼年期(出生后3周)和青春期(出生后6周)接受糖水消耗實驗和曠場實驗測試，也表現出抑郁樣行為。這說明孕期慢性疼痛對親代和子代抑郁都能起到促發作用，其危害是長期而深遠的。然而我們注意到，慢性疼痛組子鼠到了成年期(出生后9周)，其抑郁樣行為逐漸消失。這可能與生長發育期激素水平不穩定，以及受試子鼠按窩飼養，群居生活有利于抑郁情緒的改善有一定關系。但這同時也提示，慢性疼痛對親代和子代的危害或許可以通過優裕飼養(富足的食物、水、良好的飼養環境、群居生活等)來進行干預，有望改善甚至消除母體慢性疼痛帶來的不良影響。

綜上所述，孕期慢性疼痛對母體和子代造成的危害是巨大而長遠的，應當引起廣大科研工作者的充分重視并積極探索早期干預方案。

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Effects of chronic pain on the depression behavior of pregnant mice and their offspring

LI Li1，CHEN Cui2，HUANG Yue1，TAN Ying- chun1，ZHOU Fang1

(1.NursingSchoolofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221004，China; 2.DepartmentofICU，AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity，Xuzhou221002，China)

Objective: To construct the animal model of chronic pain in pregnant mice，observe the effects of chronic pain on the depression behavior of pregnant mice and their offspring. Methods: The pregnant mice were divided into control group，sham- operation control group and chronic pain group(n=10).In the chronic pain group，aseptic complete Freund’s adjuvant 100 μl [500μg·(100μl)-1] was injected intracutaneously in the paw joint of pregnant mice to induce arthritis pain.The pain could cover the whole pregnancy(about 22 days)and 1 week after delivery.With syrup consuming experiment and open field test，the depression behavior of pregnant mice and their offspring was tested at different time points. Results: On the 12th day，18th day after making model and the 6th day after delivery，in the syrup consuming experiment，the sucrose preference degree of the female mice in the chronic pain group was significantly lower than that of the sham- operation control group(P<0.01)，and in the open field test，the straight times and the movement distance in the central quadrant of the female mice in the chronic pain group was significantly lower than that of the sham- operation control group(P<0.05 orP<0.01).The index of three groups had no difference at other time points(P>0.05).When the child mice were 3 weeks，their sucrose preference degree，straight times and movement distance in the central quadrant of the chronic pain group was lower than those of the sham- operation control group(P<0.05 orP<0.01).When the child mice were 6 weeks，their sucrose preference degree and straight times of the chronic pain group was lower than those of the sham- operation control group(P<0.05 orP<0.01).The child mice’ index of three groups had no difference at other time points(P>0.05). Conclusion: Chronic pain could spur the depression behavior of pregnant mice and their offspring.

chronic pain; pregnant mice; offspring; depression

2016- 06- 24

2016- 09- 03

國家自然科學基金資助項目(81400894)；徐州市科學技術局立項課題(KC14SH090)

周芳 E- mail:meadow_zh@hotmail.com

李麗，陳翠，黃悅，等.慢性疼痛對孕鼠及其子代抑郁行為的影響[J].東南大學學報:醫學版，2016，35(6)：938- 942.

R33- 33

A

1671- 6264(2016)06- 0938- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.06.022