采用分析技術(shù)研究喹諾酮類(lèi)藥物的雜質(zhì)譜

馬媛媛，李迎利，奧美珍，石 佳

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西 汾陽(yáng) 032200)

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采用分析技術(shù)研究喹諾酮類(lèi)藥物的雜質(zhì)譜

馬媛媛，李迎利，奧美珍，石 佳

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院，山西 汾陽(yáng) 032200)

藥物雜質(zhì)影響藥物質(zhì)量和療效，有必要掌握藥物雜質(zhì)的產(chǎn)生并采取一定的措施嚴(yán)格控制藥品質(zhì)量。喹酮類(lèi)藥物是臨床上普遍采用的抗菌類(lèi)藥物，藥物的副作用與雜質(zhì)有一定的相關(guān)關(guān)系，掌握微量雜質(zhì)的形成并避免藥物副作用具有重要意義。采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)綜合分析喹酮類(lèi)藥物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，選擇分析喹酮類(lèi)藥物的雜質(zhì)裂解規(guī)律，以期對(duì)喹酮類(lèi)藥物的藥物評(píng)價(jià)提供一定的支持。

高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；喹諾酮類(lèi)藥物；雜質(zhì)譜

喹諾酮類(lèi)化合物是一種人工合成的抗菌藥物，化合物結(jié)構(gòu)母核是4-喹諾酮，藥物通過(guò)選擇性抑制細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶，干擾細(xì)菌DNA復(fù)制實(shí)現(xiàn)抗菌作用。喹諾酮類(lèi)化合物在母核的C-6位置引入氟原子，C-7位置引入哌嗪環(huán)等衍生基團(tuán)增強(qiáng)了藥物的抗菌性[1]。喹諾酮類(lèi)藥物主要包括環(huán)丙沙星、雙氟沙星、諾氟沙星等，在臨床上應(yīng)用廣泛，是一種具有生物兼容性好、抗菌效率高等優(yōu)點(diǎn)的藥物。在治療呼吸道、泌尿生殖道感染、皮膚感染等疾病有可觀療效，但研究表明，喹諾酮類(lèi)化合物藥物的雜質(zhì)會(huì)引起惡心、頭疼、頭暈、高血壓、光毒性等不良反應(yīng)[2]。喹諾酮類(lèi)藥物中母核取代基種類(lèi)和位置直接影響藥物抗菌效果并引起藥物的不良反應(yīng)，因此，研究喹諾酮類(lèi)藥雜質(zhì)物構(gòu)效關(guān)系可以了解取代基對(duì)藥效和不良反應(yīng)的影響，改善藥物吸收能力及抗菌性能，對(duì)于控制藥品質(zhì)量，保證患者用藥安全具有重要意義。

本文采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究喹諾酮類(lèi)藥物的雜質(zhì)，通過(guò)在正離子檢測(cè)模式下并串聯(lián)質(zhì)譜儀分析藥物的質(zhì)譜裂解情況，定性、定量分析該藥物雜質(zhì)，為控制、優(yōu)化、評(píng)價(jià)喹諾酮類(lèi)抗菌藥物提供一定的理論技術(shù)支持。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要樣品和試劑

本次實(shí)驗(yàn)選取常見(jiàn)的喹諾酮類(lèi)抗菌藥：左氧氟沙星、馬波沙星、伊諾沙星、妥舒沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、西諾沙星、普盧利沙星均購(gòu)置于中國(guó)食品藥品檢定研宄院。

乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，購(gòu)于天津光復(fù)藥品廠；氨水和其他試劑均為分析純，購(gòu)于天津化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水均為二次超純水，購(gòu)于天津水廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)儀器：BSA-220.4電子天平，上海卓精電子天平；3860A超聲波清洗儀，天津科貝爾光電技術(shù)有限公司；20-1000 μL微量移液器，北京卓信偉業(yè)科技有限公司；超高效液相色譜-質(zhì)譜儀,美國(guó)waters公司。

實(shí)驗(yàn)條件：流動(dòng)相采用80%甲醇：20%水，色譜柱采用Waters C18，柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min；質(zhì)譜全掃描，確定峰形及峰響應(yīng)，設(shè)置電離模式ESI+，配備Analyst數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)，離子源溫度400 ℃，采用在線性離子講模式的子離子掃描，質(zhì)量掃描范圍100～500 m/z。

1.3 制備樣品溶液

稱(chēng)取喹諾酮類(lèi)抗菌藥溶入溶劑中，其中奧比沙星的溶劑為含0.1%甲酸的甲醇，西諾沙星的溶劑為乙腈，其余其他抗菌藥溶劑為乙醇，超聲溶解，配制成1 mg/mL的儲(chǔ)備液備用。

1.4 樣品處理和進(jìn)樣

取適量?jī)?chǔ)備液樣品，用色譜甲醇稀釋配制成100 ng/mL的進(jìn)樣溶液，采用進(jìn)樣器每次吸取進(jìn)樣量為1 μL樣品注入高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，樣品進(jìn)樣前均過(guò)0.22 μL的有機(jī)濾膜。

1.5 數(shù)據(jù)處理

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)藥物的雜質(zhì)信號(hào)，進(jìn)行MDF和MMDFs計(jì)算，軟件采用Peakview和Metabolite ID，基本流程是數(shù)據(jù)采集、篩查雜質(zhì)、表征雜質(zhì)結(jié)構(gòu)并確認(rèn)等，排除背景離子的干擾。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子化效果考察

在正離子存在的ESI條件下考察選取的喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的離子化效果，實(shí)驗(yàn)表明，在正離子存在的模式條件下，藥物離子化程度較好，豐度良好。因此，選擇的初始條件是可行的，此外為保證實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性嘗試的負(fù)離子模式的離子化效果ESI條件下可以正確分析喹諾酮類(lèi)抗菌藥物峰形。

根據(jù)選擇喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的母核結(jié)構(gòu)可知，在(+)ESI-MS條件下，離子化的分子離子形式為[M+H]+，同時(shí)還可以觀察到如[M+Na]+等加合離子[4]。因此，在離子化效果較好的正離子模式下選擇[M+H]+進(jìn)行質(zhì)譜峰分析，研究具有代表性的喹諾酮類(lèi)抗菌藥物峰形的裂解情況。

2.2 質(zhì)譜裂解特征分析

左氧氟沙星、馬波沙星的4-喹諾酮結(jié)構(gòu)母核的N-1和C-8位置由取代基連接形成六元環(huán)，羧基取代了C-3位，并在C-6位引入氟原子。[M+H]+質(zhì)譜峰分析的結(jié)果是可以看到[M+H-H2O]+、[M+H-CO2]+等，氟原子電離出HF子離子，生成主要質(zhì)合比m/z特征離子，其中馬波沙星六元環(huán)的氮原子可能會(huì)發(fā)生六元環(huán)開(kāi)環(huán)斷裂[2]，具體見(jiàn)表1。

表1 左氧氟沙星、馬波沙星質(zhì)譜數(shù)據(jù)

伊諾沙星、妥舒沙星的4-喹諾酮結(jié)構(gòu)母核的C-8位置由氮原子取代，羧基取代了C-3位，裂解過(guò)程中[M+H]+質(zhì)譜峰分析結(jié)果是可以看到[M+H-H2O]+離子，脫水離子正是由于3位取代羧基脫水形成的，伊諾沙星的N-1位取代的乙基會(huì)裂解分成乙烯分子，伊諾沙星、妥舒沙星的C-6位置由氟原子取代，C-7位的雜環(huán)取代基可能丟失裂解成C2H5N離子，又或者有伯胺基團(tuán)丟失分子氨[5]，具體質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 伊諾沙星、妥舒沙星質(zhì)譜數(shù)據(jù)

環(huán)丙沙星、諾氟沙星的4-喹諾酮結(jié)構(gòu)母核中，羧基取代了C-3位，哌嗪環(huán)或哌嗪衍生物占據(jù)C-7位的取代基，C-6位含有氟原子。在正離子裂解過(guò)程中[M+H]+質(zhì)譜峰分析結(jié)果是可以看到[M+H]+、[M+Na]+、[M+H-H2O]+離子，脫水離子正是由于3位取代羧基脫水形成的，C-6位的氟原子可能脫離形成HF[2]。C-7位的哌嗪環(huán)取代基可能丟失裂解成C2H5N離子或者C3H7N、C4H8N等中性離子形成的子離子，低質(zhì)量的質(zhì)合比有裂解的m/z 72、84、98的特征離子，具體質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 環(huán)丙沙星、諾氟沙星質(zhì)譜數(shù)據(jù)

西諾沙星、普盧利沙星的4-喹諾酮結(jié)構(gòu)母核中，羧基取代了C-3位，其他結(jié)構(gòu)差異較大。在正離子裂解過(guò)程中[M+H]+質(zhì)譜峰分析結(jié)果也是可以看到[M+H]+、[M+Na]+、和3位取代羧基脫水形成的[M+H-H2O]+脫水離子[6]。西諾沙星的C-6和C-7位連接成環(huán)，脫去一分子水，研究表明亞甲二氧基是促使連接成環(huán)的主要基團(tuán)。普盧利沙星的C-2位和N-1位形成四元環(huán)，哌嗪環(huán)的4位被取代，裂解丟失形成m/z 360、350、248子離子。具體質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 西諾沙星、普盧利沙星質(zhì)譜數(shù)據(jù)

采用正離子模式下的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的質(zhì)譜情況，比較不同喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的裂解情況，結(jié)果顯示喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的母核結(jié)構(gòu)基本未發(fā)生主要變化，碎片離子的形成是取代基取代的結(jié)果[7]。質(zhì)譜結(jié)果顯示[M+H]+的豐度較強(qiáng)，[M+Na]+豐度較弱，還有3位羧基的化合物會(huì)裂解脫去一分子水，含哌嗪環(huán)的會(huì)裂解產(chǎn)生低質(zhì)合比的子離子，含N-1位取代的可能發(fā)生四元環(huán)裂解反應(yīng)，而取代基的C-6或C-8位置的氟原子會(huì)發(fā)生脫去成HF相關(guān)離子[2]。上述研究可以分析喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的結(jié)構(gòu)識(shí)別與鑒定，在篩選喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的雜質(zhì)及結(jié)構(gòu)提供重要依據(jù)。

2.3 雜質(zhì)分析

文章選擇喹酮類(lèi)藥物中的左氧氟沙星進(jìn)行雜質(zhì)研究，其中左氧氟沙星的標(biāo)品和含雜質(zhì)的混合測(cè)定顯示在離子峰最弱的質(zhì)合比為336的峰形時(shí)其S/N大于10，實(shí)驗(yàn)表明該方法適用性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)藥物雜質(zhì)含量最低為0.02%，是完全達(dá)到ICH要求的喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的雜質(zhì)濃度[9]。因此，采用上述方法對(duì)左氧氟沙星雜質(zhì)分析，研究發(fā)現(xiàn)左氧氟沙星存在17個(gè)雜質(zhì)信號(hào)，并且大部分雜質(zhì)是強(qiáng)制破壞過(guò)程中藥物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，具體見(jiàn)表5。

表5 左氧氟沙星雜質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)

將雜質(zhì)的標(biāo)品與上述雜質(zhì)譜進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，其保留時(shí)間、一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息基本一致，采用Analyst軟件的Library search功能對(duì)雜質(zhì)標(biāo)品和雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜圖的一致性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)結(jié)果顯示兩者匹配度高達(dá)95%以上。因此，采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，串聯(lián)質(zhì)譜分析雜質(zhì)結(jié)構(gòu)是可行的，在鑒別喹酮類(lèi)抗菌藥物的微量雜質(zhì)是合理的。

3 結(jié) 論

本文在分析喹酮類(lèi)抗菌藥物質(zhì)譜裂解的基礎(chǔ)上，代表性選取左氧氟沙星研究雜質(zhì)定性分析研究，對(duì)比裂解規(guī)律探討雜質(zhì)種類(lèi)和形成過(guò)程，結(jié)果表明該方法可以專(zhuān)屬性尋找喹酮類(lèi)抗菌藥物的雜質(zhì)信息，雜質(zhì)的形成通常是發(fā)生了酸性條件下的脫羧反應(yīng)、氧化條件下脈嗪環(huán)的氧化反應(yīng)和強(qiáng)光條件下哌嗪環(huán)開(kāi)裂等途徑。因此，雜質(zhì)的產(chǎn)生途徑為指導(dǎo)醫(yī)藥生產(chǎn)、儲(chǔ)存等過(guò)程中注意實(shí)驗(yàn)、儲(chǔ)運(yùn)條件，保持藥物的穩(wěn)定性提供了理論支持。

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Study on High Performance Liquid Chromatography and Mass Spectrometry Technology Used in Quinolones Impurity Spectrum

MAYuan-yuan,LIYing-li,AOMei-zhen,SHIJia

(Fenyang College of Shanxi Medical University, Shanxi Fenyang 032200, China)

Drug impurities influence drug’s quality and efficacy, it is necessary to master the production of drug impurities and take certain measures to strictly control the quality of drugs. Fluoroquinolone drugs commonly use in clinical antimicrobial drugs, there is a certain correlation between the side effects of drugs and impurities, master trace impurity formation and has important significance to avoid the side effects of the drug. The high performance liquid chromatography and mass spectrometry technology was used for quinolone drugs selection, analysis of mass spectrometry data and impurity decomposition of fluoroquinolone drugs, to provide certain support to the evaluation of fluoroquinolone drugs.

high performance liquid chromatography and mass spectrometry; quinolones; impurity spectrum

馬媛媛(1987-)，女，助教，主要從事無(wú)機(jī)非金屬材料的制備與應(yīng)用。

O657.63

A

1001-9677(2016)023-0107-03