毛竹花粉的形態及雙受精過程研究

張 瑩， 孫立方,2， 冉 洪， 馮 云， 張 韞， 郭起榮*

( 1. 國際竹藤中心， 國家林業局竹藤科學與技術重點開放實驗室， 北京 100102； 2. 南開大學 生命科學院， 天津 300071 )

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毛竹花粉的形態及雙受精過程研究

張 瑩1， 孫立方1,2， 冉 洪1， 馮 云1， 張 韞1， 郭起榮1*

( 1. 國際竹藤中心， 國家林業局竹藤科學與技術重點開放實驗室， 北京 100102； 2. 南開大學 生命科學院， 天津 300071 )

由于實驗的材料、條件和技術的限制，關于竹類花粉形態、花粉管生長過程的研究十分少見。毛竹(Phyllostachysedulis)屬于禾本科(Poaceae/Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物，在我國廣泛分布，具有重要的經濟、生態和文化價值。由于其獨特的生殖生物學特性，即開花周期長、結籽率低，所以對其開花材料的獲取十分困難。該研究在其獨特的開花特性基礎上，結合野外實地觀察，利用顯微鏡、環境掃描電鏡、熒光顯微鏡等，對毛竹的花粉形態、結構以及花粉管的萌發與生長動態進行了首次報道。結果表明：(1)毛竹花粉近球形，平均直徑為61.00 μm，屬于大型孢子。(2)毛竹成熟花粉落到雌蕊柱頭上后，經過花粉與柱頭的成功識別，開始萌發，并形成花粉管；隨著花粉管的逐漸伸長生長，依次經過柱頭和花柱，到達子房；約120 min后到達珠孔處，進入胚珠和胚囊，完成雙受精作用。通過對毛竹花粉形態結構和花粉管生長至受精過程的動態觀察，為毛竹花粉可授性、花粉生理、生化研究提供了實驗技術準備。該研究結果完善和豐富了毛竹乃至整個禾本科植物在生殖生物學方面的研究內容。

毛竹， 花粉形態， 花粉萌發， 雙受精作用， 熒光顯微技術

竹類植物是禾本科(Poaceae/Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物的總稱，全世界約88屬，1 400多種，是全球森林生態系統的重要組成部分，具有重要的生態、經濟和文化價值，被公認為 2l 世紀世界上最重要的植物資源之一(Isagi et al，2004)。毛竹在我國廣泛分布，具有重要的經濟、生態和文化價值(江澤慧，2002；周芳純，1998)。根據最新數據(第八次全國森林資源清查報告)，我國竹林面積為601 萬hm2，其中毛竹林面積為443 萬hm2，占整個竹林面積的74%(國家林業局，2014)。然而，由于毛竹開花周期長達60 a，對于獲取生殖生物學方面的材料比較困難，所以對其開花方面的研究也比較少見。絕大多數竹類植物以無性繁殖為主、一生只開花一次，開完花后植株即死亡，開花周期在六七十年以上，造成竹類花粉的采集十分困難(王曙光等，2006；盧江杰等，2009)。早在 20 世紀 80 年代，對13種竹子(不包含毛竹)的花粉大小、形態、萌發進行了研究，發現竹子花粉存在大量敗育現象(張文燕等，1989)。

花粉的形態及其萌發雖然屬于植物發育解剖學的經典基礎內容，但是限于儀器設備、試驗材料選取和實驗操作條件等限制，進展緩慢。如：關于水稻花粉萌發、花粉管生長動態的研究在2007年才有了第一次報道(陳士強等，2007)。在中國，廣袤分布，具有絕對產量、產業地位的毛竹(Phyllostachysedulis)長期不開花，制約著其在生殖發育學方面的研究。關于其開花解剖學方面的研究僅見南京林業大學等機構在20世紀70年代末對江西興國局部地區開花的毛竹林進行了生殖生物學方面的研究(喬士義和廖光廬，1984；喬士義，1984)。國際竹藤中心郭起榮種質資源課題組于21世紀初調查發現，廣西桂林海洋山一代的毛竹林從“解放前”到現在一直零星開花，即開始了對毛竹生殖發育方面的系統研究工作。已經有毛竹花器官形態，花序結構，花粉保存條件等方面的研究報道(王青等，2012；孫立方等，2013；周建梅等，2015)。

鑒于毛竹生殖發育最基本的花粉，其形態結構和生長發育過程方面的研究都是空白。本研究采用先進的熒光顯微觀察技術，首次對自然開花毛竹的花粉形態、結構，以及花粉管的生長動態進行了觀察，旨在探明毛竹花粉的形態，及花粉管在柱頭、子房中的動態生長過程，為開展花粉生理、生化研究提供實驗技術，同時竹類植物開花等生殖生物學方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2010-2015年逐年，分別于廣西區桂北海洋山，用硫酸紙收集處于盛花期的毛竹花粉。試驗地氣候屬于中亞熱帶氣候，海拔近1 000 m，年均溫為18.5 ℃，1月平均氣溫7～8 ℃，7月平均氣溫28～29 ℃，≥10 ℃的積溫為5 500～6 000 ℃，4-9月為雨季，年平均降水量為1 800 mm。

1.2 方法

將收集到的新鮮花藥，平鋪在未使用的硫酸紙上，于陰涼處自然風干30～60 min。隨著花藥囊的開裂，輕輕抖落花粉，密封保存于潔凈、干燥的離心管中，儲存于冰盒內，帶回實驗室用于后續研究。

用干凈的毛筆，輕輕蘸取適量花粉，輕撒在新的載玻片上，并滴加1～2滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，毛竹花粉玻片制作完成。在顯微鏡(LEICA DM LB2)20倍物鏡下，觀察毛竹花粉玻片(隨機選取5個視野)，并對花粉直徑大小進行測量。

圖 1 毛竹花粉形態觀察 A. 顯微鏡下的花粉形態 (10×)； B. 掃描電鏡下的 花粉形態 (2 000×)； C. 萌發孔 (1. 萌發孔， 2. 孔環) (6 000×)。Fig. 1 Pollen shape observation of Phyllostachys edulis A. Pollen shape in the microscope (10×)； B. Pollen shape in the scanning electron microscope (2 000×)； C. Germinal aperture of pollen (1. Germinal aperture, 2. Circle) (6 000×).

圖 2 毛竹花粉萌發與受精 A. 熒光顯微鏡下的柱頭 (10×)； B. 掃描電鏡下萌發的花粉 (500×)； C. 授粉40 min后的 花粉管 (10×)； D. 授粉120 min后的花粉管 (10×)； E. 授粉120 min后的子房 (受精) (40×)。Fig. 2 Pollen germination and fertilization of Phyllostachys edulis A. Stigma under fluorescence microscope (10×)； B. Germinal pollen under scanning electron microscope (500×)； C. Pollen tube after pollination 40 min (10×)； D. Pollen tube after pollination 120 min (10×)； E. Ovary (fertilization) after 120 min (40×).

在毛竹開花林中，選取不同竹株，每株1～2個樣枝，做好標記。在花藥剛剛裂開時，用干凈毛筆收集花粉，并涂抹在還未授粉的小花柱頭上，進行雌蕊授粉。

授粉后，分別于1、2、3、5、10、20、30、40、60、120 min，用鑷子采集授粉小花5～10朵，放入盛有FAA固定液的離心管中，進行固定；固定24 h后，將授粉小花保存于70%的酒精溶液中，并帶回實驗室進行后續觀察。

在實驗室中，對進行過固定處理且已授粉的小花子房，依次用濃度為50%、30%、10%的酒精溶液進行梯度復水處理；用2 mol·L-1的NaOH溶液對復水后的小花子房進行軟化12 h，并用蒸餾水清洗2次；用0.05%的苯胺藍溶液染色，放置12 h；將染色后的小花子房放在新的、干凈的載玻片上，滴1滴甘油，蓋上蓋玻片(不能有氣泡產生)；將制作好的小花子房玻片置于熒光顯微鏡下，進行觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 花粉的形態結構

在顯微鏡下，觀察、測量花粉的大小(圖1： A)。對36粒花粉的直徑大小進行了測量，結果發現花粉平均直徑為61.00 μm(最小直徑51.20 μm，最大直徑68.25 μm)，毛竹花粉屬于大型孢子。

采用環境掃描電鏡，對毛竹的花粉進行形態觀察(圖1： B)，結果發現毛竹花粉近球形，外壁紋飾為細顆粒狀；有一個圓形的萌發孔(圖1： C)，萌發孔的內、外孔徑分別為4.52和8.69 μm。

2.2 花粉的萌發與受精

竹類植物花絲細長，花粉小而無粘性，易隨風傳播，為風媒花植物(江澤慧，2002)。本研究在野外條件下發現，毛竹小花屬開張型；在開花時，其稃片張開，雄蕊伸出，雌蕊露出，柱頭為羽狀三裂。

毛竹花粉成熟后，開始進行傳粉和受精過程(孫立方等，2012)(圖2： A，B)。成熟花粉粒落到柱頭上后，先吸水膨脹，經過花粉與柱頭的相互識別，開始萌發。在本研究中發現，花粉落到柱頭上40 min后，有大量的花粉粒萌發(圖2： C)；隨后，花粉管生長、伸長，遠大于花粉粒直徑。花粉管經過花柱，到達子房(圖2： D)；約120 min后，花粉管伸到珠孔，從珠孔進入胚珠和胚囊，完成雙受精過程(圖2： E)；形成胚胎，發育成種子(圖3)。

圖 3 毛竹種子Fig. 3 Seeds of Phyllostachys edulis

3 討論

本研究采用掃描電鏡、熒光顯微鏡等設備，對毛竹的花粉形態結構，花粉管的生長動態過程，以及毛竹的雙受精過程進行了觀察。測得的毛竹花粉平均直徑(61.00 μm)，大于異葉苦竹(Arundinariasimoniif.albostriatus)的平均直徑(27.86 μm)和鵝毛竹(Shibataeachinensis)的平均直徑(40.22 μm)(林樹燕，2009；林樹燕等，2009)；也大于水稻(Oryzasativa)(20 μm)、玉米(Zeamays)(40 μm)、狼尾草(Pennisetumsp.)(22 μm)的花粉直徑(劉志玲等，1999)。本研究還發現，毛竹花粉為近球形，這與異葉苦竹、鵝毛竹的花粉形態相似(林樹燕，2009；林樹燕等，2009)，而顯著區別于禾本科的水稻(棒狀)、玉米(球形)、狼尾草(橢圓形)的花粉形態(劉志玲，1999)。毛竹花粉外壁紋飾為細顆粒狀，具有一個圓形的萌發孔，與異葉苦竹、鵝毛竹的外壁紋飾相近，而與水稻、玉米、狼尾草的外壁紋飾有顯著區別。毛竹成熟花粉落到雌蕊柱頭上后，經過相互識別，開始萌發，花粉管形成。隨后，花粉管逐漸伸長生長，依次經過柱頭、花柱，到達子房，從珠孔處進入胚珠、胚囊，完成雙受精過程。喬士義和廖光廬(1984)僅報道了毛竹的胚胎發育，本研究彌補了毛竹花粉形態特征的空白，并報道了花粉管的生長動態過程，豐富和完善了毛竹生殖生物學方面的研究。

有了前期的花粉發育解剖研究基礎，可為毛竹花粉的可授性、可授期觀察奠定基礎，為毛竹的種子生產提高人工授粉成功率；同時，為毛竹花粉的生理、特別是生化研究積累經驗。近期可見麻核桃、普通核桃的花粉生理特性比較研究(陳夢華等，2015)，文章中測定了其花粉的可溶性蛋白質含量，保護酶(超氧化物歧化酶SOD，過氧化物酶POD及過氧化氫酶CAT)的活性、丙二醛(MDA)的含量。同樣，花粉、柱頭的相互識別是受精成功的必要前提。在受精過程中，要經過3個層次的識別，即花粉、柱頭的相互識別；花粉管、花柱的相互識別；雌雄配子之間的相互識別。任何一個部位不能成功識別，都會導致受精失敗，從而產生敗育現象(袁坤，2004)。Dong et al(2013)在對毛竹花粉與柱頭間識別的初步研究中也同樣發現，花粉壁在受精過程中起著重要的作用，其不僅與柱頭的識別過程有關，而且在花粉發育中起著關鍵的作用。關于花粉壁等相關方面的進一步研究，還有待于對實驗設備和技術的完善，需要進行更深入的分析，積累大量數據。

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Pollen morphology and double fertilization ofPhyllostachysedulis

ZHANG Ying1, SUN Li-Fang1,2, RAN Hong1, FENG Yun1,ZHANG Yun1, GUO Qi-Rong1*

( 1.InternationalCenterforBambooandRattan,SFAKeyLaboratoryofBambooandRattanScienceandTechnology,Beijing 100102, China; 2.CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity, Tianjin 300071, China )

Due to the limitations of experimental materials, conditions and techniques, the research on bamboo pollen morphology and the process of pollen tube growth are very rare.Phyllostachysedulis(moso bamboo) (Bambusoideae, Poaceae) is the most important bamboo species, which has large cultivation area and is widely cultivated in China. It has important economic value for its versatile culms and delicious shoots. Besides, moso bamboo also has important ecological and cultural values. It it well known that moso bamboo has a prolonged vegetative phase lasting decades or even longer. The flowering cycle is very long and has low seed setting rate, which leads to the hardness of researching on the flower ofP.edulis. Thus, the vegetative (asexual) propagation is the main way of moso bamboo reproduction. In order to investigate the mechanism of blooming of moso bamboo, the pollen’s morphology, structure and the growth dynamic of pollen tube ofP.eduliswere observed by using scanning electron microscope and microscope based on the special blossoming characteristics of moso bamboo, which was the first report about moso bamboo pollen. The results showed that the pollen belonged to large spores. It was subglobose in the scanning electron microscope. The average diameter of pollen was 61.00 μm. The ornamentation of its outer wall was fine granular and has a round germinal aperture. There was a porous circle around the germination aperture. The outer diameter of the germinal aperture was 8.69 μm and the inner diameter was 4.52 μm. The mature pollen ofP.edulisfell onto the stigma and began to germinate and formed the pollen tube. After 40 m, a large number of pollen on the stigma began to germinate. The pollen tube grew gradually, through the stigma tissue and stylet, which finally reached to the ovary. After 120 m, the tube reached to the micropyle, and then entered into the ovule and completed fertilization in sac. Finally, the embryo developed into seeds. Through the observation of pollen morphology, germination and double fertilization ofP.edulis, this study provides theories and methods for further research on the stigma receptivity, physiological and biochemical of moso bamboo’s pollen, improving and enriching the research content of bamboo plant reproductive biology at the same time.

Phyllostachysedulis， pollen shape， pollen germination， double fertilization， fluorescence microscopic observation

10.11931/guihaia.gxzw201511010

2015-12-15

2016-04-23

國家科技支撐計劃項目 (2013BAD01B06-3) [Supported by the National Key Technology R & D Program of China (2013BAD01B06-3)]。

張瑩(1989-)，女，河南新鄉人，碩士研究生，主要從事竹子種質資源研究，(E-mail)yingzhang28@126.com。

*通訊作者： 郭起榮，博士，教授，博士生導師，一直從事竹子種質資源的研究，(E-mail)QRGUO@icbr.ac.cn。

Q943

A

1000-3142(2016)11-1325-05

張瑩， 孫立方， 冉洪， 等. 毛竹花粉的形態及雙受精過程研究 [J]. 廣西植物， 2016， 36(11):1325-1329

ZHANG Y, SUN LF, RAN H， et al. Pollen morphology and double fertilization ofPhyllostachysedulis[J]. Guihaia， 2016， 36(11):1325-1329