肉及肉制品中大鼠成分PCR檢測方法研究

李宗夢，趙良娟，馬興，趙宏，鄭文杰，張宏偉，武鵬程，尹長城

（1.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461；2.北京華大蛋白質研發中心有限公司，北京101318）

肉及肉制品中大鼠成分PCR檢測方法研究

李宗夢1，趙良娟1，馬興1，趙宏1，鄭文杰1，張宏偉1，武鵬程2，尹長城2

（1.天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，天津300461；2.北京華大蛋白質研發中心有限公司，北京101318）

我國肉類摻假現象屢禁不止，尤以使用來源不明的鼠肉冒充高價肉販賣最為惡劣。褐家鼠（Rattusnorvegicus）俗稱大鼠，由于分布廣、數量多、體型較大的特點最容易成為肉類摻假的來源。針對我國缺乏肉及肉制品中大鼠成分檢測方法的問題，本研究針對包括大鼠在內的共17種動物線粒體cytb基因序列進行分析比對，設計特異性檢測引物。該方法特異性好，可檢出混合樣品中低至0.1%的大鼠成分，靈敏度較高。結果表明，本方法對熱處理混合肉樣品和市售樣品也具有較好的檢測能力，靈敏度達到0.1%。本研究為肉類食品安全監管提供了新方法。

肉制品；PCR；大鼠；食品摻假

2013年初隨著歐洲“馬肉風波”這一食品安全事件的發生，食品摻假這一全球性問題引發了公眾對食品安全的擔憂以及各國政府的關注。我國常見肉類摻假現象多以在牛羊肉中摻入價格便宜的豬肉、鴨肉為主，更為惡劣的是有媒體報道某些不法商販用死老鼠肉制成羊肉串進行販賣。此類惡性摻假行為多見于流動攤販，難于監管。作為各種疫病傳播的載體，人食用鼠肉制品存在感染疫病的風險，還可能導致鼠藥二次中毒。由此可見，此類惡性肉類摻假事件已經嚴重威脅到消費者健康和公共安全，對政府監管部門和檢測機構提出了新的挑戰。

褐家鼠（Rattusnorvegicus），別稱溝鼠、大家鼠或挪威鼠，是我國最常見和危害最大的一種家鼠。由于其體型大、分布廣、數量大，最容易成為鼠肉摻假的來源。除此之外，用于科學研究的實驗大鼠，如Wistar大鼠[1]、Sprague Dawley大鼠[2]等也屬于褐家鼠種。此類大鼠使用量大且經過未知藥物處理，其肉制品一旦流入市場，將對食品安全造成嚴重威脅。

近年來基于核酸和蛋白質的多種分子生物學物種鑒定方法被相繼開發和應用。相較于蛋白質，DNA熱穩定性高，物種間多態性豐富，使其成為重要分子靶標。其中，線粒體DNA在細胞中含量豐富，進化速度快，用作遺傳分析靈敏度高，具有較高的種間多樣性和較低的種內變異[3-5]。常用的線粒體靶基因有細胞色素b（cytb）基因[6-8]、12S和16S核糖體RNA亞基[9-10]、D-loop區[11-13]等。基于線粒體靶基因設計特異性引物，應用單重或多重PCR技術對動物源性成分進行定性或半定量鑒別已被研究者廣泛采用[14-18]。然而，鼠源性成分尤其是大鼠成分鑒定的研究較少且大多以細胞系污染分析為目的。如Almeida等采用多重PCR及測序技術分析小鼠細胞系中短串聯重復序列（Short tandem repeat）進而對其進行鑒別[19]。Higgins等采用單重PCR法，使用商品化試劑盒對膠質細胞系進行鑒別以區分大鼠、小鼠來源的細胞系污染[20]。食品中尤其是肉及肉制品中鼠源性成分鑒別方法鮮見報道。

本研究通過分析褐家鼠（Rattusnorvegicus）及其他常見畜禽品種線粒體細胞色素b（cytb）基因序列，設計并篩選可特異性擴增褐家鼠目的片段的PCR引物，所得PCR產物大小為397 bp。結果顯示，該方法特異性好，靈敏度可達到0.1%，適用于肉及肉制品中大鼠源性成分檢測。

1 材料

1.1 樣品

大鼠新鮮組織樣本由天津中醫藥大學饋贈。其余16種用于特異性實驗的動物樣本或基因組DNA為本實驗室儲備樣品，均在識別動物整體形態條件下采樣，經過基因組測序和比對確認為相應物種。靈敏度實驗中作為基質的羊肉樣品購買于本地超市，依照行業標準SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法》確認羊成分。從天津市濱海新區農貿市場、超市、燒烤攤共購買18份羊肉制品。其中羊肉串9份、冷凍羊肉卷、羊肉片6份、羊肉餡3份。從福建省寧化縣、龍巖、南平及廣西宜州購買可食用鼠肉制品共4份，均為熏制鼠肉干。所有樣品使用無菌水清洗去除多余的腌漬醬料、骨、皮部分，使用潔凈的均質器進行混勻。

1.2 儀器與試劑

主要儀器包括終點PCR儀（PTC-200，MJResearch，加拿大），GelDoc XR凝膠分析系統（Bio-Rad Laboratories，美國），核酸蛋白分析儀（1510，Thermo Fisher，美國）。動物組織基因組提取試劑盒購自Promega公司；HSEx Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、6 x Loading Buffer購自大連寶生物公司。引物合成和測序均由上海生物工程公司完成。

1.3 引物設計

從GenBank中獲得大鼠及其他16種常見畜禽動物線粒體cytb基因序列，物種及序列信息見表1。

表1 物種GenBank序列號Table1 GenBank accession number of anim als

使用Geneious6.0（Biomatters Ltd.，New Zealand）進行序列分析，設計大鼠特性引物Rat-CYT-F1/R1。擴增片段大小為397 bp，引物序列見表2。

表2 大鼠PCR引物序列Table2 Primer sequenceof ratspecific PCR

2 方法

2.1 基因組DNA提取

依照Promega公司動物組織基因組提取試劑盒操作說明對本研究中所有動物組織進行基因組DNA提取，初始樣本量為10mg。

2.2 核酸純度及濃度測定

提取的DNA樣品采用核酸蛋白分析儀進行純度和濃度測定。A260/A280比值介于1.8～2.0之間的DNA樣品用于后續PCR擴增。

2.3 PCR反應體系

20μLPCR反應體系中含10×PCR buffer（含Mg2+）2μL；10mmol/LdNTP混合液2μL；引物（5μmol/L）各0.8μL；HSEx Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2μL；DNA模板（10μg/mL）1μL。

2.4 PCR擴增條件

94℃預變性5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃ 30 s；72℃5min，30個循環。PCR擴增產物采用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測分析。

3 結果與分析

3.1 引物特異性實驗

采用2.3、2.4中PCR體系及反應條件，以無菌水為空白對照，對雞、鴨、鵝、貓、狗、豬、馬、牛、水牛、綿羊、驢、鹿、駱駝、兔、貂、狐貍以及大鼠基因組DNA進行擴增，驗證引物的特異性。擴增結果見圖1。

圖1 引物特異性實驗PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Gelelectrophoresisof PCR products in specificity test

如圖1所示，引物Rat-CYT-F1/Rat-CYT-R1對大鼠DNA擴增出陽性條帶，擴增片段大小為397 bp。其他16個物種及空白對照擴增為陰性，說明該引物對檢測大鼠成分具有良好的特異性。將擴增產物測序、比對，結果顯示擴增片段序列分別與大鼠cytb基因目的片段具有100%同源性，進一步確證了PCR擴增的準確性。

3.2 絕對靈敏度實驗

將大鼠基因組DNA進行10倍梯度稀釋，制成100、10、1、0.1、0.01μg/mL的模板。以無菌水為空白對照，按2.3、2.4中反應體系對模板進行擴增。擴增結果見圖2。

圖2 絕對靈敏度實驗PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Gelelectrophoresisof PCR products in absolutesensitivity test

結果顯示，隨稀釋度增加，大鼠陽性擴增條帶逐漸減弱，其中模板濃度為100、10、1、0.1μg/mL時均出現陽性條帶。而0.01μg/mL及空白對照擴增為陰性。確定其最低絕對靈敏度為0.1μg/mL。

3.3 實際靈敏度實驗

選用常見摻假對象羊肉作為基質肉，制備大鼠肉與基質肉的梯度混合樣品。混合比例為10%、1%、0.1%、0.01%。混合肉樣品進行基因組DNA提取，濃度調整為10μg/mL。以大鼠DNA作為陽性對照，以羊DNA作為陰性對照，以無菌水作為空白對照，按2.3、2.4中反應體系對模板進行擴增。擴增結果見圖3。

圖3 實際靈敏度實驗PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Gelelectrophoresisof PCR productsam plified from meat m ixture

結果顯示，大鼠陽性對照、比例為10%、1%、0.1%的大鼠肉、羊肉混合樣品均能擴增出條帶。隨大鼠肉混合比例下降，條帶亮度有下降趨勢。而0.01%混合比例及陰性對照、空白對照均未出現擴增條帶。該結果顯示本方法可用于檢測混合肉中大鼠成分，靈敏度可達到0.1%。

3.4 高溫處理對方法靈敏度的影響

將3.3中所述大鼠肉、羊肉混合樣品經100℃處理30min，按2.1所述方法進行基因組DNA提取。以大鼠DNA作為陽性對照，以羊DNA作為陰性對照，以無菌水作為空白對照，按2.3、2.4中反應體系對模板進行擴增。擴增結果見圖4。

圖4 高溫處理樣品PCR擴增產物電泳圖Fig.4 Gelelectrophoresisof PCR productsam plified from heat treatedm eatm ixture

結果顯示，10%、1%、0.1%混合肉樣品經過高溫處理后仍可以成功擴增出目的條帶，隨大鼠成分比例下降，條帶擴增亮度下降趨勢相較于未經熱處理樣品更為明顯（見圖3）。而0.01%混合比例及陰性對照、空白對照均未出現擴增條帶。此結果說明經高溫處理的樣品應用本方法時，擴增效率會有所降低，但仍能將0.1%混合比例的樣品中大鼠成分檢出，方法穩健性較好。

3.5 市售肉類樣品檢測

以大鼠DNA作為陽性對照，以無菌水為空白對照，用建立的方法對18份市售羊肉制品及4份鼠肉制品進行大鼠成分檢測。結果見圖5。

圖5 市售肉類樣品大鼠成分擴增產物電泳圖Fig.5 Gelelectrophoresisof PCR productsamplified from comm ercialm eat products

凝膠電泳結果顯示，從市面購得的所有羊肉制品均未檢出大鼠成分，而4種鼠肉制品均檢出大鼠成分。空白對照則無擴增。將4種鼠肉制品PCR陽性產物進行測序，結果與GenBank數據庫中大鼠基因序列具有>99%同源性。

4 結論

考慮到經濟利益和可獲得性，小鼠體型小、可獲得肉含量不足以驅使鼠肉摻假行為。而分布最廣、來源多、肉含量大的褐家鼠（大鼠）則可能成為不法分子非法添加的目標。為解決我國肉及肉制品中大鼠成分檢測方法不足的問題，本研究通過搜集大鼠及其他16種常見畜禽動物線粒體cytb基因序列并進行分析比對，設計篩選出大鼠特異性引物。實驗結果表明，本方法對16種動物基因組DNA均無非特異擴增，具有很好的特異性。在肉制品加工過程中常見的腌制、熏制及高溫加熱等處理方式往往造成DNA損傷或降解，最終影響獲得的DNA質量[21]。結果表明，本方法可成功檢測混合生肉制品及熱處理混合肉制品中大鼠成分，靈敏度為0.1%，對于加工肉制品也具有一定的適用性。Fang等報道了采用Taqman探針法可對鼠源性成分進行實時熒光PCR擴增，但該方法無法區分大鼠、小鼠成分[22]。此外，實時熒光PCR方法成本高，對技術人員要求也較高，不利于推廣使用。本方法基于傳統PCR方法，成本低、操作簡便，更適用于一些經費有限的實驗室采用，有助于相關部門對肉類食品安全實施監管。

[1] Clause B T.TheWistar Institute Archives:Rats(NotMice)and History[J].MendelNewsletter,1998,2(7):20-24

[2] Crincoli CM,Nikiforov A I,Rihner M O,et al.A 90-day oral(dietary)toxicity and mass balance study of corn starch fiber in Sprague Dawley rats[J].Food Chem Toxicol,2016,97(11):57-69

[3]Murugaiah C,Noor ZM,Mastakim M,etal.Meatspecies identification and Halal authentication analysis usingmitochondrial DNA[J]. MeatScience,2009,83(1):57-61

[4] Girish PS,Anjaneyulu A S,Viswas K N,etal.Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)ofmitochondrial 12S rRNA gene[J]. MeatScience,2005,70(1):107-112

[5]V Fajardo,IGonzález,M Rojas,etal.A review of currentPCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J].Trends in Food Science&Technology,2010,21(8):408-421

[6] Tobe SS,Linacre A M.A multiplex assay to identify 18 European mammal species from mixtures using themitochondrial cytochrome b gene[J].Electrophoresis,2008,29(2):340-347

[7] Kumar D,Singh SP,Karabasanavar N S,et al.Authentication of beef,carabeef,chevon,mutton and pork by a PCR-RFLP assay of mitochondrial cytb gene[J].JFood SciTechnol,2014,51(11):3458-3463

[8]BarakatH,El-Garhy H A,MoustafaMM.Detection ofpork adulteration in processed meat by species-specific PCR-QIAxcel procedurebased on D-loop and cytb genes[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2014,98(23):9805-9816

[9] Karlsson A O,Holmlund G.Identification ofmammal species using species-specific DNA pyrosequencing[J].Forensic Sci Int,2007, 173(1):16-20

[10]Abuzinadah OH,Yacoub H A,El AshmaouiH M,etal.Molecular detection ofadulteration in chicken productsbased onmitochondrial12S rRNA gene[J].MitochondrialDNA,2015,26(3):337-340

[11]Mane BG,Mendiratta SK,Tiwari A K.Polymerase chain reaction assay for Identification of chicken in meat and meat products[J]. Food Chem,2009,116(3):806-810

[12]Girish PS,Haunshi S,Vaithiyanathan S,et al.A rapidmethod for authentication of Buffalo(Bubalusbubalis)meatby Alkaline Lysis method ofDNA extraction and speciesspecific polymerase chain reaction[J].JFood SciTechnol,2013,50(1):141-146

[13]Karabasanavar N S,Singh SP,Kumar D,et al.Detection of pork adulteration by highly-specific PCR assay ofmitochondrial D-loop [J].Food Chem,2014,145(4):530-534

[14]Kesmen Z,Sahin F,Yetim H.PCR assay for the identification ofanimalspecies in cooked sausages[J].MeatScience,2007,77(4):649-653

[15]Martín I,García T,Fajardo V,et al.Technical note:detection of chicken,turkey,duck,and goose tissues in feedstuffsusing speciesspecific polymerase chain reaction[J].JAnim Sci,2007,85(2):452-458

[16]段慶梓,尚柯,張玉,等.多重PCR法用于雞、鴨肉源性的鑒定[J].食品研究與開發,2014,35(5):90-93

[17]Di Pinto A,Forte V T,Conversano M C,et al.Duplex polymerase chain reaction fordetection ofporkmeatinhorsemeat fresh sausages from Italian retailsources[J].Food Contr,2005,16(5):391-394

[18]Karabasanavar N S,Singh SP,Kumar D,et al.Detection of pork adulteration by highly-specific PCR assay ofmitochondrial D-loop [J].Food Chem,2014,145(4):530-534

[19]Almeida JL,Hill CR,Cole K D.Mouse cell line authentication[J]. Cytotechnology,2014,66(1):133-147

[20]Higgins SC,Steingrimsdottir H,Pilkington G J.Human,mouse or rat?Species authentication of glioma-derived cell cultures[J].J NeurosciMethods,2010,194(1):139-143

[21]Saez R,Sanz Y,ToldráF.PCR-based fingerprinting techniques for rapid detection of animalspecies inmeatproducts[J].MeatScience, 2004,66(3):659-665

[22]Fang X,Zhang C.Detection of adulterated murine components in meatproductsby TaqMan C real-time PCR[J].Food Chem,2016, 192(1):485-490

Detection of Rat Com ponents in M eat and M eat Products by PCR

LIZong-meng1，ZHAO Liang-juan1，MAXing1，ZHAOHong1，ZHENGWen-jie1，ZHANGHong-wei1，WUPeng-cheng2，YINChang-cheng2
（1.Animal，Plantand Foodstuffs Inspection Center，Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China；2.Beijing Protein Innovation Co.，Ltd.，Beijing101318，China）

Meat fraud has been a problem for a long time in China.Adulteration ofmurinemeatwith unknown resource intohigh pricedmeathasbeen theworst.Brown rat（Rattusnorvegicus）which isnormally referred asrathasbecome themost possible resource formeatadulteration due to its broad distributions，large population and bigger size.There is lack ofdetectionmethod aimingat ratcomponents inmeatandmeatproducts in China. In this study，sequences of cytb gene coming from 17 animal species including ratwas analyzed and a pair of primers specifically targeting ratwas designed.The primers showed high specificity and sensitivity bywhich 0.1 %of ratmeat inmeatmixturewasdetectable.Moreover，thismethod wasalsoapplied to heat treatedmeatmixturesand commercialmeatproductswith sensitivity of0.1%.Thisstudy provided anew tool to control thequality ofmeatproducts forofficial laboratories.

meatproducts；PCR；rat；food fraud

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.026

2016-10-24

國家質檢總局科技項目（2015IK278）

李宗夢（1983—），女（漢），工程師，博士，研究方向：食品安全檢測。