GPC-UPLC-MS/MS法測定食用油中壬基酚和雙酚A

錢鐳，李秀軍，曲雙雙，肖光輝，劉婷，*

（1.黑龍江東方學院食品與環境工程學部，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江飛鶴乳品有限公司，黑龍江齊齊哈爾 162100）

GPC-UPLC-MS/MS法測定食用油中壬基酚和雙酚A

錢鐳1，李秀軍1，曲雙雙1，肖光輝2，劉婷1，*

（1.黑龍江東方學院食品與環境工程學部，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江飛鶴乳品有限公司，黑龍江齊齊哈爾 162100）

建立食用油中壬基酚和雙酚A的凝膠滲透色譜（GPC）-超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）分析檢測方法。食用油樣品經乙酸乙酯-環己烷溶解，GPC凈化后，采用超高效液相色譜-串聯質譜法分析測定。儀器使用WATERS ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱，以甲醇-0.1%氨水為流動相，梯度洗脫分離后，串聯四極桿質譜多反應監測方式檢測，采用內標法定量。分析結果表明，目標物檢出限為1.0μg/kg，在1.0μg/kg～5.0×102μg/kg的范圍內呈良好的線性關系（R2>0.99），試驗中平均添加回收率85.1%～112.5%，相對標準偏差2.57%～6.08%。

壬基酚；雙酚A；凝膠滲透色譜；超高效液相色譜-質譜聯用；食用油

壬基酚（Nonylphenol，NP）和雙酚A（bisphenol A，BPA）是具有代表性的環境激素，兩者作為內分泌干擾物質，可以通過食物鏈進入人體，并在人體內富集。NP對人體癌細胞的生長和生殖能力具有嚴重影響，此前已被歐盟列為優先危害物質[1]。BPA主要是影響哺乳動物的生殖以及后天的發育[2]，引起生殖器官異常和雄性雌性化等方面的危害[3]。食用被NP、BPA污染的農作物生產的食用油時會使NP、BPA在人體內積累，同時NP、BPA具有良好的增塑性，一些食品包裝企業使用NP、BPA作為包材增塑劑，大量應用于食品包材及容器內部涂層[4]。此外NP和BPA具有較強的脂溶特性，當使用以NP、BPA作為增塑劑的容器盛裝食用油時，NP和BPA就會從容器中溶出，長期食用該類食用油將會使NP、BPA在體內大量富集從而影響人體的生殖和內分泌系統，破壞人體健康。截止目前奧斯陸-巴黎公約（OSPAR）已經將NP列入優先控制污染物質名錄當中[5]。歐盟2003EC指令也規定商品中NP的含量不得高于0.1%，加拿大衛生部于2008年宣布禁止進口和銷售含有BPA的嬰兒奶瓶[6]。中國于2011年1月12日將NP、BPA添加至有毒物質限制名單中，禁止NP、BPA化學品的進出口[7]。

凝膠滲透色譜（gel permeation chro-matograph，GPC）又稱體積排除法，是使用目標物質的優良溶劑作為流動相，內部分離介質采用多孔交聯高分子凝膠的液相色譜法。GPC作為一種樣品凈化手段，在樣品富含脂肪、色素等物質時分離效果較其他方法更加具有優勢[8]。

目前NP、BPA的檢測主要以生物、環境、玩具等方面為主[9]，應用GPC法檢測食用油中的NP、BPA幾乎未見報道。研究建立GPC-UPLC-MS/MS的檢測方法法對食用油中的NP、BPA進行定量分析。該法準確高效，可以為食用油中的環境激素檢測分析提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用油：市售色拉油；乙酸乙酯（色譜純）：美國SIGMA；環己烷（色譜純）：美國Fisher公司；甲醇（色譜純）：德國默克公司；氨水（優級純）：哈爾濱試劑化工廠；壬基酚和雙酚A標準品及同位素內標（純度> 99%）：Dr.EhrenstorferGmbH（上海安譜公司代購）；試驗用水：Milli-Q凈化系統過濾。

1.2 主要儀器與設備

UPLC-TQD超高效液相色譜-質譜聯用儀：美國Waters公司；AccuPrepTM自動凝膠色譜系統：GPC，美國J2 Scientific公司，配有內裝BIO-Beads S-X3填料的凈化柱（400mm×20mm，美國J2公司）；SI-0256渦旋振蕩器：美國SIVortex-Genie；Milli-Q超純水器：美國，Millipore公司；N-EVAP112水浴氮吹儀：美國OA公司。

1.3 標準溶液的配制

分別稱取壬基酚和雙酚A的固體標準品各10mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成100μg/mL的標準儲備液，置于2℃～8℃冰箱冷藏。使用時根據需要，用甲醇稀釋成不同濃度的工作液。

分別稱取壬基酚和雙酚A的固體內標物各20mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成200μg/mL的內標儲備液，置于2℃～8℃冰箱冷藏。

1.4 樣品處理

樣品提取：準確稱取食用油樣品0.2 g（精確至0.01 g）于10mL玻璃試管中，加入內標后再加入環己烷-乙酸乙酯（體積比1∶1）溶液溶解定容，渦旋均勻，經0.22μm微孔濾膜過濾后，供GPC上機，同時進行試劑空白試驗。樣品經GPC凈化后，供UPLC-MS/MS檢測分析。試驗中所用玻璃器具，使用前在400℃馬弗爐內灼燒4 h。

1.5 GPC凈化條件

凝膠柱300mm×20mm，Bio Beads SX-3作為柱填料；環己烷/乙酸乙酯（體積比為1∶1）作為流動相；流速：5.0mL/min；進樣量：5mL；收集時間：6min～16min；檢測波長：254 nm。

1.6 超高效液相色譜條件

捕集柱：Waters Isolator Column（P/N186004476），捕集柱位于進樣閥之前；色譜柱：ACQUITYUPLCBEH C18柱，1.7μm，2.1mm×50.0mm；柱溫：35℃；流速：0.3mL/min；進樣量：10μL；流動相：A為0.1%的氨水，B為甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件Table1 M obilephaseand gradientelution conditions

1.7 質譜分析條件

質譜條件：離子源，電噴霧電離ESI（-）；離子源溫度150℃；脫溶劑溫度400℃；脫溶劑氣流量800 L/h；錐孔氣流量50 L/h；毛細管電壓2.8 kV；采用多反應監測模式采集。具體的離子采集參數見表2。

表2 壬基酚和雙酚A質譜采集參數Table2 MSparametersof NP and BPA

2 結果與分析

2.1 流出時間的選擇

試驗選用環己烷-乙酸乙酯作為流動相，選擇流速：5.0mL/min；進樣量：5mL；檢測波長：254 nm，在此條件下對目標樣品進行凝膠滲透色譜流出時間測定，得出最佳收集餾分時間，見圖1。

圖1 NP和BPA混合樣品凝膠滲透色譜流出圖Fig.1 NP and BPAm ixed samp leGPC outflow Figure

由圖1可以確定NP和BPA最佳的收集餾分時間為6min～16min，且兩種目標物質的回收率均大于80%。

2.2 凈化條件優化

目前國內的樣品凈化方式多為萃取柱提取，由于食用油中含有大量的脂肪以及色素類物質，對于一般的提取方式而言有很大的干擾，會影響對目標物質的提取效果。這種條件下凝膠滲透色譜可以更加有效的達到預期效果，它具有重現性好、回收率高、適用于多殘留分析等特點[10]。綜合考慮采用凝膠滲透色譜進行樣品的凈化以及目標物的提取。

2.3 樣品提取劑優化

目前樣品提取所使用的試劑多為丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷以及環己烷-乙酸乙酯等。本次試驗針對上述不同試劑對NP、BPA提取效果做出分析，為NP、BPA選擇最佳的提取試劑，并計算各試劑提取NP、BPA的回收率。試驗結果見圖2。

圖2 不同提取劑提取雙酚A和壬基酚混合樣品回收率圖Fig.2 Differentextraction agentextraction of BPA and NPm ixed samp le recovery Figure

由圖2數據得出：丙酮、甲醇以及正己烷的回收率均達不到理想標準。二氯甲烷在提取BPA時回收率最高，但提取NP的效果相對較低，而環己烷-乙酸乙酯提取NP、BPA時的回收率都較好可以滿足試驗要求，且回收率大體持平。綜合考慮，本試驗選用環己烷-乙酸乙酯作為樣品的提取溶劑。

2.4 流動相的選擇

選擇甲醇-水和乙腈-水作為流動相，比較兩種流動相發現，乙腈-水保留時間較短，但乙腈-水作為流動相時的響應值明顯低于甲醇-水作為流動相時的響應值，故首次試驗選擇甲醇-水作為流動相。在后續試驗中發現，使用甲醇-水時BPA的回收率相對較低，此現象表明流動相存在一定的基質干擾。而弱堿性緩沖液具有增加靈敏度的效果，但考慮堿性太強會使色譜柱壽命縮短[11]，所以本方法在流動相中加入0.1%的氨水促進目標化合物的進一步電離同時也避免高濃堿液對色譜柱的損害，從而提高了分離效果，在本試驗條件下，兩種化合物在3min內完全分離，達到預期效果。

2.5 質譜條件的選擇

對NP、BPA進行痕量分析，使用多反應監測模式（MRM）。NP、BPA均含有羥基基團，如要得到理想的分離離子[M-H]-需要在負離子的模式下進行分析[12]。先需要測定待測物的母離子以及子離子（正壬基酚只產生單一的子離子），再對各待測化合物的毛細管電壓、脫溶劑溫度、錐孔電壓等條件進行確定，最佳質譜條件如表2所示。NP、BPA的多反應監測（MRM）色譜圖見圖3。

圖3 雙酚A和壬基酚標準品的MRM譜圖Fig.3 Chromatogram sof BPA，NP standardsunder MRM mode

2.6 線性方程、相關系數及檢出限

在上述UPLC-MS/MS儀器條件下測定2種待測化合物混合標準系列溶液，分別配置濃度1.0μg/kg～5.0×102μg/kg的NP、BPA標準溶液。以定量離子的峰面積Y對相應的濃度X（μg/kg）進行回歸分析。NP、BPA的線性范圍、線性方程和相關系數以及方法檢出限見表3。

由表3可知NP、BPA物質在1.0μg/kg～5.0×102μg/kg范圍內具有良好的線性關系。

表3 BPA、NP的線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限Table3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients and LODsof BPA and NP

2.7 回收率與精密度

在樣品中添加不同濃度的混合標準溶液，加標水平為1.0、3.0、5.0μg，每個水平設6個平行，按上述試驗條件進行處理和測定，得出食用油中NP與BPA的平均加標回收率在85.1%～112.5%之間，其相對標準偏差為2.57%～6.08%，由此可見，該方法精密度良好。具體結果見表4。

表4 食用油中壬基酚和雙酚A的加標回收率與相對標準偏差Table4 Recoveriesand RSDs for NP，BPA in edibleoil

2.8 實際樣品的測定

應用上述試驗方法，隨機對市售食用油選取其中六種品牌相同包裝的產品進行檢測分析，分析結果見表5。

表5 實際樣品的測定Table5 Determ ination of realsamples

根據上述試驗方法（GPC-UPLC-MS/MS）對實際樣品進行分析檢測。由表5可以看出市售食用油樣品2以及樣品5中均未檢出NP和BPA。NP在樣品1、3、4中檢測含量為3.03、2.04、5.56μg/kg，BPA在樣品1樣品6中檢測含量為0.62、2.12μg/kg。表明部分市售食用油當中可以檢出少量NP、BPA，該項檢測方法使用前景廣闊。

3 結論

初步建立了食用油中NP和BPA的GPC-UPLCMS/MS分析檢測方法。樣品以環己烷-乙酸乙酯（體積比1∶1）溶液溶解，經GPC凈化，以UPLC-MS/MS檢測，方法所得NP與BPA的平均加標回收率在85.1%～112.5%之間，其相對標準偏差為2.57%～6.08%。該方法準確、操作簡單且靈敏度高，能夠較好的應用于食用油中NP和BPA的分析檢測。

[1] Soell M,Elkaim R,Tenenbaum H,et al.Matrixmetalloproteinases and their tissue inhibitors in gingivalcrevicular fluid from periodontitis-affected patients[J].2002,26(3):174

[2]吳永寧,江桂斌.重要有機污染物痕量與超痕量檢測技術[M].北京:化學工業出版社,2007:597

[3]永烈,梁星.種植義齒學第1版[M].北京:北京醫科大學中國協和醫科大學聯合業版社,1999:117-123

[4]馬強,白樺.高效液相色譜法對紡織品和食品包裝材料中的壬基酚、辛基酚和雙酚A的同時測定[J].分析測試學報,2009,38(2): 197-201

[5]KANNAN K,KEITH T L,NAYLOR C G,et al.Nonylphenol and nonylphenolethoxylates in fish,sediment,and water from the Kalamazoo River,Michigan[J].Arch Environ Contam Toxicol,2003,14(4): 77-82

[6]俞雪鈞,谷云云,馮睿,等.高效液相色譜串聯質譜法同時測定海產品中雙酚A及烷基酚殘留[J].華中農業大學學報,2014,33(3): 52-59

[7]環境保護部.《中國嚴格限制進出口的有毒化學品目錄》[EB/OL]. 2013年 第 85號公告:http://www.zhb.ggkml/hbb/bgg/201312/ W020131231541093586216.pdf,2014-1-1/2016-2

[8]劉艷琴,王浩,楊紅梅,等.凝膠滲透色譜-高效液相色譜法測定植物油中苯并芘[J].食品科技,2013,38(1):327-328

[9]肖全偉,黎源倩,張浩,等.高效液相色譜法測定大鼠血清中4-壬基酚和雙酚A[J].四川大學學報(醫學版),2004；35(2):271-273

[10]廖雅樺,周冀衡.凝膠滲透色譜-高效液相色譜-串聯質譜法測定煙草中50種農藥殘留量[J].湖南農業大學學報(自然科學版), 2010,36(4):404-409

[11]王天嬌,林勤保,安歡,等.超高效液相色譜串聯質譜法測定食品包裝紙中的酚類物質[J].分析測試學報,2012,12(29):1153-1157

[12]羅紀軍.液相色譜串聯質譜法測定乳品中雙酚A和壬基酚[J].食品科學現代農業科技,2015(1):288-289

Determ ination of NP and BPA in Edible Oil by GPC-UPLC-MS/MS

QIAN Lei1，LIXiu-jun1，QUShuang-shuang1，XIAOGuang-hui2，LIUTing1，*
（1.Instituteof Food Engineering，Heilongjiang EastCollege，Harbin 150086，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Feihe Dairy Co.，Ltd.，Qiqihaer162100，Heilongjiang，China）

Amethod that gel permeation chromatography（GPC）-ultra performance liquid chromatographymassspectrometry（UPLC-MS/MS）used toanalysisand detectnonylphenoland bisphenol A in fatskind foods was established.Samples were dissolved in ethyl acetate-cyclohexane，using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis after GPC purification.The experiment used WATERSACQUITY UPLCBEH C18 column，withmethanol-0.1%aqueousammonia as themobile phase gradientelution rear tandem quadrupole mass spectrometry with multiple reaction monitoring mode detection using internal standardmethod.The analysis showed thatselected objectdetection limitof1.0μg，in the range of1.0μg/kg～5.0×102μg/kg showed a good linear relationship（R2>0.99），the add recovery ratio on average of85.1%-112.5%and the relative standard deviation of2.57%-6.08%.

NP；BPA；GPC；UPLC-MS/MS；edible oil

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.034

2016-03-17

錢鐳（1981—），男（漢），副教授，工學博士，研究方向：乳品工程。

*通信作者