不同產區濃香型白酒窖泥中細菌多樣性分析

于春濤，劉超

（滄州醫學高等?？茖W校，河北滄州061001）

不同產區濃香型白酒窖泥中細菌多樣性分析

于春濤，劉超

（滄州醫學高等專科學校，河北滄州061001）

以十里香窖泥（河北滄州）、景陽春窖泥（山東景芝鎮）、瀘州老窖窖泥（四川瀘州）和龍江家園窖泥（黑龍江雙城）為研究對象，利用變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）和基因測序技術對窖泥中的細菌和乳酸菌的多樣性進行分析。結果表明：在4種窖泥樣品景陽春窖泥中細菌多樣性最低，龍江家園窖泥中細菌多樣性最高；十里香窖泥中乳酸菌的多樣性最低，瀘州老窖窖泥中乳酸菌的多樣性最高。窖泥中的細菌以厚壁菌門為主，乳酸菌以乳酸桿菌為主，不同產區窖泥中細菌和乳酸菌的組成存在著差異。上述結果說明濃香型白酒窖泥中細菌多樣性與其產區之間存在一定聯系。

濃香型白酒；窖泥；細菌；乳酸菌；多樣性；變形梯度凝膠電泳

白酒是一種由糧食發酵而來的蒸餾酒，其中以濃香型的白酒產量最高，并且由其濃郁的窖香風味深受人們的喜愛[1-2]。窖泥在濃香型白酒生產過程中發揮著重要的作用，并在長期的演化過程中形成了其獨特的微生物特征，并通過這些微生物的發酵會賦予白酒獨特的風味[3-4]。不同地區的濃香型白酒其組成成分和風味具有顯著的差異，造成這些差異的主要原因是其窖泥中微生物的不同，因此對不同產區濃香型白酒窖泥進行微生物多樣性的分析十分必要[5-6]。

濃香型白酒窖泥中的微生物包括了細菌、古細菌和真菌，其中細菌是窖泥微生物中優勢的群體，此外，乳酸菌在濃香型白酒的發酵過程中發揮著重要的作用，其代謝產物乳酸乙酯有助于白酒風味的形成[7-8]。本研究利用變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技術揭示不同產區窖泥中細菌和乳酸菌多樣性的差異，為闡述不同產地濃香型白酒酒體風格不同的原因提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 主要材料

1.1.1 樣品來源

窖泥分別采自十里香窖泥：河北滄州；景陽春窖泥：山東景芝鎮；瀘州老窖窖泥：四川瀘州；龍江家園窖泥：黑龍江雙城，分別標號為A、B、C和D，窖齡均為30年。每個窖池選取其上層、中層和底部進行采樣，混合后-20℃保藏待用。

1.1.2 主要試劑

MIBIO UltraClean SoilDNA Isolation Kit、2×Taq PCRMasterMix（含染料）、Marker I：均購自北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖：南京生興生物；無水乙醇：上海博谷生物；引物BA338f和UN518r，Lac1和Lac2，40 bp“GC”：北京諾賽基因組研究中心有限公司。

1.2 試驗儀器

TG328A電子分析天平：上海精科天美儀器有限公司；TD5A-WS臺式大容量離心機：常州市萬合儀器制造有限公司；HH-8恒溫水浴鍋：常州市金壇區環宇科學儀器廠；BG-Power600通用電泳儀電源：上海珂淮儀器有限公司；變性梯度凝膠（DGGE）電泳儀：美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 樣品DNA提取及PCR擴增

根據鄧杰等[9]的報道，利用MIBIOUltraClean SoilDNA Isolation Kit對不同產區的窖泥細菌DNA進行提取。以上述DNA為模板，對其進行細菌16S rRNA V3區和乳酸菌PCR擴增。細菌16SrDNAV3區擴增采用通用引物BA338f和UN518r（5’-端加一個40bp“GC”夾），乳酸菌擴增引物采用Lac1和Lac2（5’端加一個40 bp“GC”夾），反應體系和擴增條件參考已有報道[10-11]。

2.2 DGGE分析

細菌16SrDNA V3區DGGE分析的變性凝膠梯度為30%～55%，上樣量為30μL、反應溫度為60℃、電壓120 V、電泳14 h[12]；乳酸菌DGGE分析采用30%～50%的變性梯度，上樣量為30μL、反應溫度為60℃、電壓70V、電泳16 h[11]。電泳結束后將DGGE膠用去離子水清洗，之后在1%的GeneFinder中避光染色30 min，UVP凝膠成像記錄DGGE圖譜，并利用Shannon-Weaver指數分析窖泥細菌度多樣性。

2.3 基因測序

將染色后的膠體至于紫外燈下，利用無菌手術刀快速切割膠體中不同位置的條帶，去離子水清洗，搗碎，加入50 uL去離子水，在4℃冰箱過夜。以上清液為模板，采用沒有GC夾的引物進行PCR擴增，對PCR產物進行測序分析，并將測序得到的基因序列在NCBI數據庫中進行Blast比對，確定條帶所代表的菌株的菌屬。

3 結果與分析

3.1 不同產區窖泥中細菌和乳酸菌PCR擴增結果

利用1%瓊脂糖凝膠電泳分別對窖泥中的細菌DNA和乳酸菌DNA擴增產物進行檢驗，結果如圖1所示。

圖1不同產區窖泥DNA擴增產物Fig.1 Amplification productof DNA of pitmud sam ples from different producing regions

圖1 （a）中，4個窖泥樣品DNA的16S rRNAV3區擴增產物的目的條帶均一清晰，大小都在200 bp左右，無雜帶，可認定為細菌16S rRNA V3區目的條帶。圖1（b）中，所有樣品的條帶大小在400 bp左右，條帶均一清晰，可認為為乳酸菌的目的條帶。

3.2 不同產區窖泥細菌多樣性分析

利用DGGE電泳技術分析濃香型白酒窖泥中細菌的生物多樣性，并利用Shannon-Weaver指數評估其多樣性，PCR-DGGE圖譜結果見圖2、圖3，生物多樣性結果見圖4。

圖2 不同產區窖泥樣品細菌DGGE圖譜Fig.2 DGGE profileofbacteria of pitmud sam ples from different producing regions

圖3 不同產區窖泥樣乳酸菌DGGE圖譜Fig.3 DGGE profileof lactic acid bacteria ofpitmud samples from different producing regions

由圖2和圖3中可以看出不同產區的窖泥樣本的細菌和乳酸菌DGGE圖譜中具有一定的差異，在細菌圖譜中共分離出12個不同位置的條帶，在乳酸菌圖譜中共發現8個位置不同的條帶。由圖4（a）可知，B（景陽春窖泥）窖泥中細菌多樣性最低，D（龍江家園窖泥）中細菌多樣性最高。由圖4（b）中可知A（十里香窖泥）窖泥中乳酸菌的多樣性最低，而C（瀘州老窖窖泥）窖泥中乳酸菌的多樣性最高。上述結果表明不同產區濃香型白酒窖泥中細菌和乳酸菌的多樣性存在一定的差異。

3.3 DGGE圖譜優勢條帶測序分析

利用基因測序技術對DGGE圖譜中的優勢條帶進行測序分析，條帶的位置選取如圖2和圖3所示，測序結果如表1。

表1 不同產地窖泥細菌和乳酸菌DGGE圖譜中條帶Blast對比結果Table1 Blast resultof bands in DGGE profilesof bacteria and lactic acid bacteria of pitmud sam ples from different producing regions

其中瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）、未培養的假單胞菌（Uncultured Pseudomonadaceae）、Caloramator mitchellensis、喜鹽芽孢桿菌屬（Haloballus）和Uncultured bacterium在4個產區的窖泥中均有發現；梭菌屬（Clostridium sp.）、乳酸桿菌（Lactobacillussp.）和喜熱菌（Caloramator）只存在于A（十里香窖泥）、B（景陽春窖泥）和C（瀘州老窖窖泥）中；Uncultured Synergistaceae和消化桿菌科（Peptococcaceae）只存在于D（龍江家園窖泥）中；未培養的鹽扁菌（Uncultured Haloplasmataceae）則只存在于3（瀘州老窖窖泥）中。

窖泥中乳酸菌的測序選取了8條不同位置的條帶，其中4個不同產地濃香型白酒窖泥中都含有發酵乳酸菌（L.fermentum）、乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）和未培養的乳酸桿菌（Uncultured Lacto－bacillus）；檸檬明串球菌（Leuconostoc citreum）和耐酸乳桿菌（L.acetotolerans）存在于B（景陽春窖泥）、C（瀘州老窖窖泥）和D（龍江家園窖泥）中；融合魏斯氏菌（Weissella confusa）存在于B（景陽春窖泥）、C（瀘州老窖窖泥）中；L.odoratitofui則存在于A（十里香窖泥）、B（景陽春窖泥）和C（瀘州老窖窖泥）中。

4 討論

Shannon-Wiener指數能夠用于評估樣品中微生物的多樣性，Shannon-Wiener值越高表示樣品中微生物的種類越多，其多樣性就越高[11]。本試驗中4個窖泥樣品的細菌和乳酸菌Shannon-Wiener值差異明顯，說明不同產區的濃香型白酒的窖泥中細菌和乳酸菌中的種類和數量存在著地域性的差異。在此基礎上，基因測序的結果表明，4個不同產區的窖泥中細菌和乳酸菌的種類也有所差異，這可能是不同產區濃香型白酒風味各具特點的重要原因之一。

4個不同產區濃香型白酒的窖泥中主要的細菌分別屬于Firmicutes（厚壁菌門），Synergistaceae（互養菌門），Chloroflexi（綠彎菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Acidobacteria（酸桿菌門）和Lentisphaerae（黏膠球形菌門），其中厚壁菌門為優勢菌門。其中互營共養單胞菌屬、喜熱菌屬和梭菌屬能夠產生乙酸、丙酸、丁酸等有機酸，從而進一步反應生成以己酸乙酯、丁酸乙酯為主體的復合香氣[4]。除此之外，乳酸菌也是窖泥中的功能菌，主要參與風味物質乳酸乙酯的形成。本研究中4個不同產區濃香型白酒的窖泥細菌和乳酸菌的組成既有相同菌株也有特有菌株，這說明窖泥中細菌及乳酸菌的組成既有相似的組成，也會由于不同地域土壤成分、天氣或生產工藝的差異而具有獨特性。

[1]岳元媛,張文學,劉霞,等.濃香型白酒窖泥中兼性厭氧細菌的分離鑒定[J].微生物學通報,2007,34(2):251-255

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[3]劉森.中國濃香型白酒窖池窖泥中原核微生物群落空間異質性研究[D].成都:西華大學,2013

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[6]張金修,張雪飛.探討濃香型白酒中微量成分與酒質的關系[J].釀酒科技,2013(7):72-74

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Analysis of Bacterial Diversity in Different Areas of Strong Aromatic Chinese Spirit in Pit M ud

YUChun-tao，LIUChao
（Cangzhou MedicalCollege，Cangzhou 061001，Hebei，China）

The pitmud from Shilixiang（HebeiCangzhou），King spring（Shandong JingZhi town），Luzhou laojiao（Sichuan Luzhou）and Longjiang home（Heilongjiang Shuangcheng）were the research objects.The diversity of bacteria and lactic acid bacteria were analyzed using the denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and gene sequencing technology.Among the four samples in pitmud，the bacterial diversity of King springwas the lowest，which of Longjiang homewas the highest；the diversity lactic acid bacteria of Shilixiang was the lowest，which of Luzhou laojiaowas the highest.The Firmicuteswas themain phylum in bacteria，the Lactobacilluswas the dominantgenus in lactic acid bacteria.Therewere some difference in the composition of bacteria and lactic acid bacteria in pitmud from different producing regions.These results demonstrated that therewasa connection between bacterialdiversity ofpitmud and their producing regions.

strong aromatic Chinese spirit；pitmud；bacteria；lactic acid bacteria；diversity；denaturing gradientgelelectrophoresis（DGGE）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.035

2016-08-10

于春濤（1979—），男（漢），講師，碩士研究生，主要研究方向：微生物發酵。