超高壓乳鐵蛋白液增強免疫力功能研究

陳偉，陳云，劉宇，李志偉，史玉東，魏雪濤，母智深，*

（1.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，內蒙古呼和浩特011500；2.北京大學公共衛生學院，北京001500）

超高壓乳鐵蛋白液增強免疫力功能研究

陳偉1，陳云1，劉宇1，李志偉1，史玉東1，魏雪濤2，母智深1，*

（1.內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，內蒙古呼和浩特011500；2.北京大學公共衛生學院，北京001500）

研究超高壓乳鐵蛋白液增強免疫力功能。將受試者按采用B1/FQ代加快雌性小鼠，設1.67、10、100mg/kg·bw 3個劑量組，另外設置0mg/kg·bw和10mg/kg·bw乳鐵蛋白（未經超高壓）對照組，連續給樣1個月，檢測小鼠體重、胸、脾臟器官、Con A誘導的脾淋巴細胞轉化、SRBC誘導的DTH、溶血空斑數、血清半數溶血值（HC50）、碳廓清能力、腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞、NK細胞活性的影響。100mg組在體液免疫、細胞免疫功能、促進巨噬細胞吞噬功能與對照組有顯著性（P<0.05）均為陽性，可判斷100mg劑量對小鼠有增強免疫功能。超高壓乳鐵蛋白液仍具有增強免疫力功能。

乳鐵蛋白；超高壓；動物試驗；增強免疫力

乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）是1939年由Sorensen等在動物乳中發現的一種功能因子[1]。由于其有許多生理功能，引起了各個領域學者的關注。尤其是近年來，隨著乳鐵蛋白功能的不斷闡明，其開發利用更具實用價值。研究表明，乳鐵蛋白具有很多生理和生物學功能[2]，與免疫球蛋白和其他保護性因子相協調參與局部分泌免疫，減少損傷和損傷愈合作用[3-6]。乳鐵蛋白是目前公認的具有多效免疫調節活性的蛋白質，其對機體的免疫調節作用將會越來越受到重視，它可以影響多種免疫細胞，包括淋巴細胞、巨噬細胞、朗罕氏細胞等[7]。有理由相信，乳鐵蛋白將會成為未來免疫調節治療的重要手段之一，但其調節機體免疫的機制仍需進一步深入探討。然而乳鐵蛋白在熱的條件下特別容易失活以及降解。早在1977年,RUEGG等就研究了牛乳超濾透過液中的牛乳鐵蛋白的熱穩定性,在pH值為6.6、溫度為65℃～69℃時開始失活。此后，人乳鐵蛋白的熱穩定性得到系統研究,結果表明對70℃加熱處理已使它完全降解[8]。

超高壓（UHP，ultrahigh pressure）是在室溫或溫和加熱條件下，利用100MPa～1 000MPa的壓力處理食品,以達到殺菌、鈍酶和加工食品的目的[9]。當食品物料在液體介質中體積被壓縮之后，形成高分子物質立體結構的氫鍵、離子鍵和疏水鍵等非共價鍵即發生變化，結果導致蛋白質、淀粉等發生變性，酶失去活性，細菌等微生物被殺死[10]。為了驗證超高壓條件下的乳鐵蛋白液是否失活，以及超高壓的乳鐵蛋白是否具有增強免疫力的功能開展本實驗。本試驗對超高壓進行了動物試驗，依據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）[11]有關規則評判對產品是否具有增強免疫力功能進行評價。為其在乳制品中應用打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

RPMI1640、Hanks液、SA緩沖液、補體、LDH基質液、MTT、熒光乳膠顆粒、Na2CO3等。

打孔器；BS2000S分析天平、BS200S-WE1電子天平：德國塞多利斯；UV2600分光光度計：日本島津；流式細胞儀：美國BD；Celculture二氧化碳培養箱、超凈工作臺：新加坡Esco；Elx808酶標儀：美國biotek；HPP HPP600MPa/30 L超高壓食品處理設備：包頭科發。

1.2 樣品制備

超高壓乳鐵蛋白液的制備：將攪拌均勻的乳鐵蛋白（新西蘭Tatua）的質量分數為10%灌裝于鋁箔袋中，經600MPa 30min壓力處理后備用。

對比組：同一批次的乳鐵蛋白。

1.3 動物及分組

選用ICR小鼠（SPF級）由北京大學醫學部實驗動物科學部提供（動物合格證號：SCXK（京）2011-0012），6周齡～8周齡，19 g～25 g，雌性300只。動物飼料：由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。飼料合格證號：SCXK（京）2014-0010。按體質量隨機組，每組12只，各取5組分別進行；SRBC誘導小鼠遲發型變態反應（DTH）、小鼠碳廓清實驗、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗、小鼠抗體生成細胞及半數溶血值（HC50）實驗、ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化及NK細胞活性實驗等5個實驗項目[11]。

1.4 飼養條件

小鼠在溫度為20℃～25℃，相對濕度為40%～70%的實驗室屏障系統中飼養。動物飼養于屏障環境中，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2012-0011。

1.5 劑量

乳鐵蛋白（乳鐵蛋白牛奶4mg/100 g）的人體推薦劑量500mL/（人·日），折算成原料粉的人體推薦劑量為20mg/（人·日）（以60 kg體質量計），設1.67、10、 100mg/kg 3個劑量組（分別相當于人體推薦攝入量的5倍、30倍、300倍），另設0mg/kg組以及10mg/kg非超高壓對照組，經口每日1次給予小鼠相應質量濃度的受試樣品，小鼠灌胃量為10mL/kg。連續灌胃1個月后測定各項增強免疫力功能指標[11]。

1.6 方法

ConA誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗（MTT法）；SRBC誘導小鼠遲發型變態反應（DTH）（足跖增厚法）；抗體生成細胞檢測（Jeren改良撥片法）；血清溶血素測定（半數溶血值）；小鼠碳廓清實驗；小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗（半體內法）；NK細胞活性測定（乳酸脫氫酶測定法）[11]。

1.7 數據分析

用SPSS10.0軟件對各實驗原始數據進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求的數據資料，用單因素方差分析方法中多個實驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理；對非正態分布或方差不齊的數據資料進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換所得的數據進行統計處理[11]。

2 結果與分析

2.1 超高壓乳鐵蛋白對小鼠體重的影響

表1為乳鐵蛋白對小鼠體質量的影響。

表1 乳鐵蛋白對小鼠體重的影響Table1 Theeffectof lactoferrin on weightofm ice

由表1可以看出，小鼠的初始體質量為1.67、10、100mg/kg組與0 g/kg組比較，差異無統計學意義。表明小鼠的初始體質量在各組間較為均衡。經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白1個月后，各劑量組體重增長值經方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個實驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理。0.08、0.17、0.50 g/kg組與0 g/kg組比較，差異無統計學意義。

2.2 對小鼠胸腺、脾臟器官的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，胸腺/體質量、脾/體質量經方法齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個實驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理，結果如表2所示。

由表2可以看出：1.67、10、100mg/kg組與0 g/kg組及10mg/kg乳鐵蛋白液比較，差異無統計學意義。

表2 乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠免疫器官重量的影響（x±s）Table2 Theeffectof lactoferrin（UHP）on theweightof immune organsofm ice（x±s）

2.3 對溶血空斑數的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，結果如表3所示。

表3 乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠IgM-PFC/脾的影響（x±s）Table3 Theeffectof lactoferrin（UHP）onm icespleen IgM-PFC（x±s）

由表3可以看出，100mg/kg對小鼠IgM-PFC/脾顯著高于其它組。10mg/kg乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠IgM-PFC/脾顯著高于對照組，而10mg/kg乳鐵蛋白液對小鼠IgM-PFC/脾與對照組無差異。

2.4 對小鼠血清溶血素的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，結果如表4所示。

表4 乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠血清溶血素的影響（x±s）Table4 Theeffectof lactoferrin on Serum hemolysin inmouse（x±s）

由表4可以看出，各劑量組與10mg/kg乳鐵蛋白液（超高壓）組與對照組相比相比對小鼠血清溶血素的影響有著現在差異，而10mg/kg乳鐵蛋白液對照組以及100mg/kg乳鐵蛋白液（超高壓）組與對照組相比存在極顯著差異（P＜0.01）。實驗發現10mg/kg超高壓乳鐵蛋白液與蛋白對照組比較，存在顯著差異。

2.5 對DNFB誘導的小鼠DTH的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，結果如表5所示。

表5 乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠DTH的影響（x±s）Table5 Theeffectof lactoferrin on DTH inm ouse（x±s）

由表5可以看出，100mg/kg組足跖增重顯著高于0 g/kg組。同時發現同劑量（10mg/kg）的超高壓乳鐵蛋白液較未超高壓的足跖增加厚度要大，但無統計學差異。

2.6 對ConA刺激的小鼠脾淋巴細胞轉化功能的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，結果如表6所示。

由表6可以看出，100mg/kg組對ConA刺激的小鼠脾淋巴細胞轉化功能顯著高于0 g/kg對照組。

2.7 對小鼠碳廓清能力的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，結果如表7所示。

由表7可以看出：1.67mg/kg～100mg/kg的乳鐵蛋白液（超高壓）和10mg/kg乳鐵蛋白液（未處理）均具有升高小鼠廓清指數的能力，表現為對吞噬功能的促進效應。與溶劑對照相比，差異具有統計學意義。10mg/kg高壓與未高壓劑量組均有極顯著差異，高壓與未高壓乳鐵蛋白對小鼠碳廓清能力的影響無差異。

表6 乳鐵蛋白液（超高壓）對ConA刺激的小鼠脾淋巴細胞轉化功能的影響（x±s）Table6 Theeffectof lactoferrin（UHP）on ConA-induced spleen lymphocyte proliferation ability ofmouse（x±s）

表7 乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠碳粒廓清功能的影響（x±s）Table7 Theeffectof lactoferrin（UHP）on carbon clearance ability inm ouse（x±s）

2.8 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光膠珠功能的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，結果如表8所示。

表8 乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光膠珠功能的影響（x±s）Table8 Theeffectof lactoferrin（UHP）on the function of phagocytosisof fluorescentbeadsofmousem acrophages（x±s）

由表8可見，100mg/kg乳鐵蛋白液（超高壓）具有促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光膠珠的能力，無論是細胞吞噬率還是平均熒光強度均較溶劑對照組升高，差異具有統計學意義。

2.9 對小鼠NK細胞活性的影響

經口給予小鼠不同劑量組的乳鐵蛋白液（超高壓）1個月后，NK細胞活性經sin-1P1/2（P為NK細胞活性，用小數表示）轉化后經方差齊性檢驗，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個實驗組與一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計處理，結果如表9所示。

表9 乳鐵蛋白液（超高壓）對小鼠NK細胞活性的影響（x±s）Table9 Theeffectof lactoferrin（UHP）on theactivity of NK cells inm ice（x±s）

由表9可以看出，各劑量組與0 g/kg組相比對小鼠NK細胞活性的影響上無統計學差異。

3 結果與討論

小鼠經口給予乳鐵蛋白液（超高壓）30天后，100 mg/kg受試物可以增強小鼠脾臟產生抗體的細胞數目，同時10mg/kg和100mg/kg受試物還增加了血清中特異性抗體的滴度，因此判斷該受試物具有增強細胞免疫功能的能力。但是處理與未處理的乳鐵蛋白在相同劑量下的作用，不完全一致，故認為二者差異不明顯。100mg/kg受試物能夠增強小鼠的遲發型變態反應和T淋巴細胞增殖能力，故判斷該受試物具有增強體液免疫功能的作用。1.67、10mg/kg和100mg/kg的受試物增強小鼠的碳粒廓清指數，同時100mg/kg受試物能促進小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光膠珠的能力，因此判斷該受試物具有促進巨噬細胞吞噬的能力。各個劑量組小鼠的NK細胞活性與溶劑對照組相比未見明顯增強。

近些年對于乳鐵蛋白輔助增強免疫力的研究也特別多，有動物和人體的研究。如2010年胡志和研究團隊，經過研究發現2、20、200mg/kg·d增強免疫力的實驗結果均為陽性，且20mg/kg·d最為顯著[12]。王艷萍[13]對乳鐵蛋白牛奶進行了人體試食研究，對上海和北京倆地志愿者食用含有不同劑量（5mg/100mL和10mg/100mL）乳鐵蛋白牛奶產品，實驗發現食用兩種不同劑量乳鐵蛋白牛奶產品的志愿者，在流感癥狀發生率、發生次數、癥狀持續天數、癥狀嚴重度、藥物治療天數和病假天數上均顯著低于安慰劑組志愿者，表明加入乳鐵蛋白的牛奶產品對提高志愿者免疫力水平有明顯作用。Petra Hellwega[14]用18只比格獵犬進行免疫評價，通過口服分別設置0、120、1 800mg/kg乳鐵蛋白喂養四個星期，結果發現口服牛奶乳鐵蛋白明顯的影響狗的細胞免疫功能并能夠降低糞便中大腸菌及產氣莢膜菌的數量。本研究結果與胡志和研究結果在低劑量組有差異，其研究發現劑量為2 mg/kg·d即有免疫增強作用，而本研究10mg/kg·d仍未發現免疫增強作用，本研究與Pope研究結果相似，Pope[15]研究發現60、120mg/d乳鐵蛋白進行狗的喂養實驗，未發現減少大腸菌群以及影響免疫功能。同時研究發現，超高壓對功能有一定的影響，但無顯著差異。乳鐵蛋白增強免疫的原理及功效量仍需要進一步研究。

綜上所述，本研究證明在一定劑量下超高壓處理乳鐵蛋白具有提高免疫力的功效，同時研究對比發現含量較低的乳鐵蛋白不能達到增強免疫力的功能，超高壓對乳鐵蛋白的功能有一些影響，超高壓后的乳鐵蛋白結構的變化與功能的變化仍待進一步研究。

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Study on the Enhancing Immunity Function of Lactoferrin by Ultre High Pressure Processing

CHENWei1，CHENYun1，LIUYu1，LIZhi-wei1，SHIYu-dong1，WEIXue-tao2，MUZhi-shen1，*
（1.InnerMongoliaMeng Niu Dairy Industry（Group）Co.，LTD，Hohhot011500，InnerMongolia，China；2.SchoolofPublic Health，PekingUniversity，Beijing100191，China）

To study the function ofenhancing immune of lactoferrin by ultra high pressure proceed.Methods：Healthy femalemice ofB1/Fqwasas the research subjects，setting five doesgroupswith 1.67，10，100mg/kg·bw（lactoferrinwasproceed by ultrahigh pressure），and 0，10mg/kg·bw（lactoferrinwithoutultrahigh pressure）. themicewere given once a day bymonthwith the appropriate concentration of tested samples.Then theweight，thymus，spleen organ，ConA-induced spleen lymphocyte proliferation，RBC-induced DTH，the number of hemolytic plaque，halfofhemolytic serum（HC50），carbon clearance ability，macrophage phagocytosisof chicken erythrocytes，NK cellactivitywere detected onemonth with the tested samples.100mg group were significantly higher than control group（P<0.05） in humoral immunity，cellular immunity function，promote macrophage phagocytic function，socan judge the 100mg dose group can be judgeenhanced immune function in mice.The resultsshowed that lactoferrin（UHP）stillhad enhancing immune function.

lactoferrin；ultrahigh pressure（UHP）；animal clinical trial；enhancing immune

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.24.039

2016-08-31

內蒙古自治區科技計劃項目（201502056）

陳偉（1980—），男（漢），工程師，碩士研究生，從事乳制品及其功能研究工作。

*通信作者：母智深，從事于乳制品研究及管理工作。