化瘀開竅解郁顆粒對腦卒中后抑郁大鼠的保護作用

喻 斌 張臻年 黃仕文 楊 麗 鄒 杰 程海波 沈祥春

(南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023)

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化瘀開竅解郁顆粒對腦卒中后抑郁大鼠的保護作用

喻 斌 張臻年1黃仕文 楊 麗 鄒 杰 程海波 沈祥春2

(南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023)

目的 探討化瘀開竅解郁顆粒(HY顆粒)對腦卒中后抑郁(PSD)大鼠的改善作用及機制。方法 首先對大鼠MCAO處理，再進行慢性應激刺激兩步完成PSD模型的復制，給藥后觀察HY顆粒對大鼠糖水消耗、開場活動情況的影響，以及對水迷宮實驗中游泳時間、游泳距離、游泳速度、近站臺區(qū)游泳距離、遠站臺區(qū)游泳距離、近/遠站臺區(qū)距離比、近站臺區(qū)時間、遠站臺區(qū)時間、近/遠站臺區(qū)時間比的影響。通過免疫組織化學法觀察HY顆粒對海馬和皮層(額葉)中腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)和神經生長因子(NGF)表達的影響。結果 HY顆粒治療后可顯著增加PSD大鼠體重、糖水消耗體積、水平活動次數、垂直活動次數，縮短總游泳距離、近站臺區(qū)的游泳距離、遠站臺區(qū)的游泳距離、游泳時間、近站臺區(qū)游泳時間、遠站臺區(qū)游泳時間，增加近/遠站臺區(qū)游泳距離比和時間比。HY顆粒還可劑量依賴性增加海馬和皮層腦區(qū)中BDNF和NGF蛋白的表達。結論 HY顆粒能促進PSD大鼠行為學改善，其機制涉及BDNF和NGF表達量的增加。

化瘀開竅解郁顆粒；腦卒中后抑郁

腦卒中后抑郁(PSD)患者除了表現情緒低落、興趣減少外，還往往出現嚴重負罪感、睡眠障礙、思維能力減弱、自殺傾向〔1〕。PSD不僅對神經系統(tǒng)功能的恢復不利，甚至還可能促使腦損傷惡化，加重影響患者的生活質量。現代醫(yī)學對于PSD的治療主要采用抗抑郁藥物，如舍曲林等，但效果并不理想，并且還可帶來如消化系統(tǒng)和神經系統(tǒng)的副作用〔2〕。傳統(tǒng)醫(yī)學認為PSD的病機在于氣滯血瘀，情志不舒，肝氣郁結，氣機失調，心失所養(yǎng)，故其治療應采用活血化瘀、開竅理氣、疏肝解郁法為主。基于該理論形成的化瘀開竅解郁治法臨床療效較好，本實驗室根據該方已制備化瘀開竅解郁顆粒(HY顆粒)。本實驗擬進一步闡明HY顆粒對PSD的藥理作用及初步機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD大鼠(體重180～220 g)，雄性，購于浙江大學實驗動物中心。HY顆粒，本實驗室制備，該方含丹參、石菖蒲、川芎、柴胡、廣郁金、茯神、香附、枳殼、青皮、紅花、桃仁、當歸、竹茹、冰片和甘草。帕羅西汀購于葛蘭素史克公司，批號14110503。Morris水迷宮行為學系統(tǒng)(淮北正華有限公司)，配合Any-maze行為學分析軟件(美國Stoeling公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組 60只大鼠，隨機分為正常組、PSD組、陽性藥組(帕羅西汀1.65 mg/kg)、HY顆粒-Ⅰ組(13.35 g/kg)、HY顆粒-Ⅱ組(26.7 g/kg)和HY顆粒-Ⅲ組(53.4 g/kg)，每組10只。

1.2.2 PSD造模和給藥方法 按照Kim等〔3〕方法進行PSD造模。大鼠用水合氯醛麻醉(350 mg/kg，ip)，仰臥于鼠板上。頸正中切口，依次分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，結扎ECA遠端并烙斷。結扎CCA近心端以及ECA和翼腭動脈。距CCA分叉處近心端 0.5 cm處插入備好的尼龍線，去除動脈夾，沿著ICA輕輕向前推至指定長度〔(18±0.5)cm〕后，將ICA和魚線一起固定后縫合皮膚。正常組大鼠手術過程相同，但不插入尼龍線。每日給予青霉素(ip，10萬U/只)，連續(xù)3 d。以大鼠出現Horner癥狀作為PSD模型成功的標志。按文獻方法進行抑郁模型的復制〔4〕。每只用小鼠籠單獨飼養(yǎng)并接受21 d的慢性應激刺激，具體包括1 d的晝夜顛倒、3 min的夾尾、5 min的4℃水游泳、5 min的160 Hz水平振蕩、24 h的禁食、24 h的禁水、2 min的電擊(30 V，電擊5 s，間隔5 s)。將上述每種刺激重復3次，形成隨機的21次刺激，1次/d，共21 d。正常組大鼠正常飼養(yǎng)。動物在接受刺激的同時灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥21 d。

1.3 指標檢測

1.3.1 體重和糖水消耗 禁水24 h后稱重。大鼠單籠飼養(yǎng)1 h，同時每只大鼠供應20 ml 1%蔗糖水，大鼠自由飲水。計算1 h大鼠糖水飲用量(ml)。

1.3.2 開場水平和垂直活動 制備無蓋鐵皮箱，箱底劃有10 cm×10 cm的格子64個。在安靜暗室，將大鼠放入箱底中心格子。以大鼠爬行路過的格子數作為水平運動次數，以大鼠后肢直立、前肢懸空或攀爬的次數為垂直運動次數，觀察3 min內動物活動情況。

1.3.3 Morris水迷宮 實驗開始前先訓練大鼠，將其引導至站臺。實驗時將大鼠放入水池的任一位置，利用Any-maze行為分析軟件獲取游泳時間、游泳距離、游泳速度、近站臺區(qū)游泳距離、遠站臺區(qū)游泳距離、近/遠站臺區(qū)距離比、近站臺區(qū)時間、遠站臺區(qū)時間、近/遠站臺區(qū)時間比等參數。

1.3.4 神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)表達的檢測 實驗結束后，將大鼠脫頸椎處死，分離海馬和額部皮層，甲醛固定，通過免疫組化法檢測BDNF和NGF的表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS12.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 HY顆粒對PSD大鼠體質量、糖水飲用量、開場水平和垂直活動的影響 PSD組與正常組比較顯著減輕大鼠體質量，減少大鼠糖水飲用量；此外，水平活動和垂直運動次數也明顯減少(P<0.05)。HY顆粒三個劑量組大鼠體質量、糖水用量、大鼠水平和垂直運動次數與PSD組比較顯著增加(P<0.05)。見表1。

組別體質量(g)糖水飲用(ml)水平運動(次)垂直運動(次)正常組212.10±13.0517.00±4.7164.20±30.6913.30±3.65PSD組155.00±12.521)9.00±1.411)14.90±4.201)3.89±1.621)陽性藥組187.00±13.622)13.20±4.492)21.50±7.692)8.90±2.332)HY顆粒-Ⅰ組 178.20±19.672)11.60±2.952)25.80±10.272)6.00±2.492)HY顆粒-Ⅱ組 197.50±12.472)13.50±3.242)32.40±11.642)8.30±3.062)HY顆粒-Ⅲ組 204.40±11.352)15.20±5.902)45.00±18.802)10.20±3.162)

與正常組比較：1)P<0.05；與PSD組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 HY顆粒對PSD大鼠Morris水迷宮實驗的影響 PSD組大鼠游泳距離、近站臺區(qū)游泳距離、遠站臺區(qū)游泳距離、游泳時間、近站臺區(qū)時間、遠站臺區(qū)時間與正常組比較顯著增加，近/遠站臺區(qū)游泳距離比、近/遠站臺區(qū)時間比顯著減少(P<0.05)。HY顆粒三個劑量組近站臺區(qū)游泳距離、遠站臺區(qū)游泳距離、游泳時間、近站臺區(qū)時間、遠站臺區(qū)時間與PSD組比較顯著縮短，同時近/遠站臺區(qū)游泳距離比、近/遠站臺區(qū)時間比明顯增加(P<0.05，0.01)。見表2。

組別游泳距離(m)游泳速度(m/s)近站臺區(qū)游泳距離(m)遠站臺區(qū)游泳距離(m)近/遠站臺區(qū)距離比游泳時間(s)近站臺區(qū)時間(s)遠站臺區(qū)時間(s)近/遠站臺區(qū)時間比正常組3.16±2.360.24±0.091.75±1.411.41±0.991.44±0.9113.99±11.986.95±5.967.04±6.321.22±0.70PSD組22.88±5.541)0.25±0.068.72±2.741)14.17±3.331)0.62±0.171)100.64±46.291)37.62±23.001)63.02±26.071)0.61±0.241)陽性藥組10.04±10.312)0.25±0.084.88±5.382)5.16±4.972)1.09±0.672)45.73±48.132)21.57±24.3924.16±24.542)0.99±0.512)HY顆粒-Ⅰ組11.26±4.032)0.25±0.105.26±2.222)6.01±1.912)0.86±0.172)50.36±23.512)23.03±11.3227.33±14.542)0.92±0.362)HY顆粒-Ⅱ組9.81±3.742)0.23±0.034.52±2.122)5.29±2.012)0.89±0.292)43.73±18.312)19.77±7.842)23.96±12.762)0.99±0.442)HY顆粒-Ⅲ組8.31±4.702)0.27±0.084.10±2.872)4.22±2.102)0.95±0.322)30.10±17.512)14.67±8.802)15.43±9.112)0.95±0.202)

2.3 HY顆粒對PSD大鼠BDNF和NGF在額葉皮層和海馬表達的影響 PSD組大鼠可見海馬和額葉皮層BDNF和NGF的表達與正常組比較顯著減少(P<0.05)。HY顆粒三個劑量組這兩個腦區(qū)NGF的表達與PSD組比較均顯著增加(P<0.05，0.01)；HY顆粒Ⅱ組和Ⅲ組與PSD組比較還可增加這兩個腦區(qū)BDNF的表達(P<0.05)。見表3。

組別BDNF皮層(額葉)海馬NGF皮層(額葉)海馬正常組3.22±0.812.57±0.783.36±1.253.48±0.43PSD組1.86±0.581)1.56±0.431)1.25±0.461)1.41±0.561)陽性藥組2.65±0.772)2.18±0.352)2.26±0.812)2.39±0.762)HY顆粒-Ⅰ組2.27±0.521.83±0.512.08±0.652)2.26±0.882)HY顆粒-Ⅱ組2.63±0.582)2.12±0.602)2.28±0.712)2.37±0.542)HY顆粒-Ⅲ組2.90±0.762)2.41±0.632)2.36±0.392)2.54±0.492)

3 討 論

額葉區(qū)域的皮層腦組織約占整個大腦皮質的40%，占有較大的面積，其功能主要是對外界環(huán)境來源的各種刺激信號進行整合，并引發(fā)機體產生相應的情緒反應。顯然，額葉皮層的病理改變，往往除了導致患者認知能力和判斷水平，還可能發(fā)生行為、情緒和情感障礙。Parikh等〔5〕對103例PSD患者進行1～2年的隨訪，發(fā)現PSD的病情發(fā)展和預后與額葉皮層區(qū)域的病變程度呈正相關，進一步驗證了額葉區(qū)皮層組織與PSD的密切聯(lián)系。顳葉內側的海馬與學習、記憶和情感的聯(lián)系也已被廣泛認可，亦被認為是引起認知障礙的主要區(qū)域。陳宇等〔6〕對PSD患者的海馬體積進行MRI檢測，結果顯示梗死后海馬組織可見體積的顯著萎縮。另外，Huang等〔7〕利用影像學技術進一步證實PSD患者的海馬組織還存在代謝障礙。以上資料顯然，海馬和額葉皮層區(qū)域神經元病變的發(fā)生及嚴重程度與PSD的發(fā)生、發(fā)展和轉歸均有著密切聯(lián)系。BDNF和NGF是重要的神經營養(yǎng)多肽，在神經元發(fā)育、成熟和分化中均有重要作用，也是評價神經元功能的重要指標〔8〕。神經元損傷往往引發(fā)這兩種多肽的表達降低，而這種降低又反過來進一步加重神經元損傷。但通過有效治療后，伴隨著癥狀的改善，BDNF和NGF含量也可顯著升高，接近正常水平〔9〕。

傳統(tǒng)醫(yī)學認為，PSD屬“中風”和“郁證”的合病。《臨證指南醫(yī)案》提出郁證的病因病機為“因郁則氣滯，氣滯久則必化火熱。熱則津液耗而不流，升降之機失度，初傷氣分，久必血分，延及郁勞沉疴”。此外，《醫(yī)學論·越鞠丸》記載：“凡郁病必先氣病，氣得疏通，則何郁之有?”，顯然，傳統(tǒng)醫(yī)學認為PSD的病因是氣血逆亂于腦所致。而對其病機的理解則是情志不舒，氣機失調，肝氣郁結，氣滯血瘀，心失所養(yǎng)。針對這一病機研制的HY顆粒具有活血化瘀、開竅理氣、疏肝解郁之效。方中丹參活血養(yǎng)血，石菖蒲醒腦開竅為君。“血中氣藥”川芎活血行氣；柴胡條達肝氣，疏解肝郁；廣郁金活血止痛，行氣解郁，清心涼血；伏神寧心安神，共為臣藥。佐以香附、枳殼、青皮行氣開郁，紅花、桃仁活血化瘀，當歸活血、養(yǎng)肝、生血，竹茹寧心除煩，以達活血養(yǎng)血、疏肝解郁除煩之功。冰片性善走竄開竅，無往不達，芳香之氣，能辟一切邪惡，辛熱之性，能散一切風濕。在前期研究中發(fā)現，冰片具有促進藥物腦內分布的作用，尤其對海馬區(qū)較為明顯，這可能也是該復方能顯著改善PSD患者認知能力低下的機制之一〔10〕。甘草則疏理肝氣，調和諸藥，共為佐使。諸藥合用，共起活血化瘀、開竅理氣、疏肝解郁之效。

綜上所述，HY顆粒能明顯改善PSD大鼠行為學異常以及糖水攝入水平，增強大鼠的空間學習和記憶能力以及對未知空間的探究興趣。此外，增加海馬和額葉皮層區(qū)域內BDNF和NGF的表達可能是該顆粒抗PSD的機制之一。

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4 喻 斌，阮 鳴，孫 永，等.電針對抑郁大鼠大腦皮層ATP結合盒式蛋白表達的影響〔J〕.針刺研究，2013；38(4)：286-90.

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6 陳 宇，徐堅民，馮敢生，等.腦梗死后抑郁癥患者海馬及杏仁核體積的MRI 研究〔J〕.放射學實踐，2009；24(6)：603-6.

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9 Pang C，Cao L，Wu F，etal.The effect of trans-resveratrol on post-stroke depression via regulation of hypothalamus-pituitary-adrenal axis〔J〕.Neuropharmacology,2015;97(5):447-56.

10 喻 斌，阮 鳴，董小平，等.不同間隔時間冰片處理對大鼠梔子苷腦靶效應的影響〔J〕.中國藥理學通報，2012；28(6)：862-6.

〔2016-01-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

The effect and mechanism of Huayu Kaiqiao Jieyu therapy on post-stroke depression

YU Bin, ZHANG Zhen-Nian, HUANG Shi-Wen,et al.

Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

Objective To research the improvement and mechanism of Huayu Kaiqiao Jieyu granules on post-stroke depression (PSD)rats.Methods The behavior of depressive rats, which were formed by MCAO combining with chronic stress, were detected by Morris water maze, syrup consuming and Open-field experiments. Moreover, the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus were measured to explore its mechanism.Results Comparing with those of model group, Huayu Kaiqiao Jieyu granules increased the body weight and syrup consuming obviously, improved open-field behaviors, shortened the total swim route, latency, time consuming and route of swimming in distant and nearby area, enhanced time consuming ratio and route ratio of swimming in nearby and distant area(P<0.05, 0.01). Moreover, this granules increased the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus markedly (P<0.05, 0.01).Conclusions The granules improves PSD disorder and the mechanisms is involved with increasing the expressions of NGF and BDNF in frontal cortex and hippocampus.

Huayu Kaiqiao Jieyu granules; Post-stroke depression

國家自然科學基金資助項目(81573713，81001651);江蘇省基礎研究計劃(BK20151564);江蘇省大學生創(chuàng)新性實踐訓練計劃

1 南京市中醫(yī)院腦病科 2 貴州醫(yī)科大學藥學院

程海波(1975-)，男，副教授，博士，主要從事中醫(yī)藥方劑研究。 沈祥春(1973-)，男，教授，博士，主要從事民族藥物研究。

喻 斌(1978-)，男，副教授，博士，主要從事中藥藥理學研究。

R749

A

1005-9202(2016)23-5771-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.002