基質相互作用分子1在紅藻氨酸致癲大鼠的表達及依達拉奉的干預作用

臧兆萍 李志茹 劉忠錦 楊曉華 高巍巍 齊寶奎

(齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院神經內科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

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基質相互作用分子1在紅藻氨酸致癲大鼠的表達及依達拉奉的干預作用

臧兆萍 李志茹 劉忠錦 楊曉華 高巍巍 齊寶奎

(齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院神經內科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

目的 觀察基質相互作用分子(STIM)1在紅藻氨酸(KA)致癲大鼠的表達及依達拉奉的干預作用。方法 50只雄性Wistar大鼠被隨機分為5組，每組10只。正常組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組、癲癇組，治療組1(地西泮治療組)，治療組2(地西泮+依達拉奉治療組)。癲癇組在大鼠右側海馬以每公斤體重注射 1.5 μg/μl KA，PBS組采取同樣的方法在相同部位注入等量PBS，治療組1在癲癇模型成立后給予10 mg/kg地西泮終止癲癇，治療組2在治療組1的基礎上1 h后再給予依達拉奉30 mg，12 h一次，正常組不注射任何藥物。結果 用激光共聚焦顯微鏡觀察，癲癇組STIM1的表達密度顯著高于PBS組及正常組(P<0.05)，治療組較正常組、PBS組及癲癇組表達增高(P<0.05)。治療組1較治療組2表達增高(P<0.05)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酯胺凝膠(SDS-PAGE)分析顯示STIM1的相對分子質量分別46 kD，并且發現其在癲癇組的表達較正常組及PBS組增加，治療組較癲癇組相比降低，所得結果與激光共聚焦的結果相一致(P<0.05)。結論 STIM1表達增加對大鼠癲癇后海馬的神經元損傷具有細胞保護作用。

癲癇；基質相互作用分子(STIM)1；紅藻氨酸

癲癇是一種神經元發作性異常放電所引起的臨床癥候群，病因復雜，發病機制尚未闡明。研究發現癲癇患者 30%～70%存在認知功能障礙〔1，2〕。癲癇在《黃帝內經》中記載，曰：“諸暴強直，皆屬于風……諸風掉眩，皆屬于肝”，中醫對于癲癇的治療多以“從肝論治”為出發點，但因受中藥成分復雜的影響，所以中藥治療極少。依達拉奉可清除自由基、抑制興奮性神經遞質谷氨酸的釋放。鈣釋放激活的鈣(CRAC)通道是鈣通道中的一種位于細胞質膜上的慢鈣通道，基質相互作用分子(STIM)1是CRAC通道關鍵蛋白中的一個，介導CRAC通道的組成和激活。本實驗研究STIM1在紅藻氨酸(KA)大鼠海馬中的表達變化及依達拉奉治療后的表達變化，旨在探討其在顳葉癲癇發生及治療中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 材料 健康成年雄性清潔級Wistar大鼠50只(體重200～250 g)，環境溫度適宜，動物實驗過程遵守中華人民共和國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》的規定。

1.2 癲癇動物模型的建立 將Wistar大鼠用10%水合氯醛1 ml(0.3～0.4 ml/kg體重)麻醉后固定，備皮，切開，剝離，按大鼠腦立體定向圖譜，以前囟為靶點定位CA3〔坐標：X=2.5 mm(右)，Y=3.0 mm，Z=3.5 mm〕鉆孔，在動物清醒和無菌的條件下，用1 μl微量注射器注入以磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的濃度為1.5 μg/μl KA 1 μl，注藥持續10～15 min，留針5 min。根據KA誘發鼠的行為學改變判定癲癇鼠模型的建立。PBS組于相同部位等時注入等量的PBS。以Racine等〔3〕行為學標準判定癲癇模型，治療組1在癲癇模型成立后給予10 mg地西泮終止癲癇，治療組2在治療組1的基礎上1 h后再給予依達拉奉30 mg,12 h一次，在正常組不注射任何藥物。

1.3 標本的制備 標本固定、包埋、切片、脫蠟、抗原修復、封閉，兔抗鼠STIM1抗體單克隆抗體(1∶100)4℃孵育過夜，第2天切片室溫復溫1 h，PBS漂洗，滴加山羊抗兔異硫氰酸熒光素(FITC)標記熒光二抗(濃度1∶50)，2.5 μg/ml碘化丙啶(PI)染色20 min后漂洗水化封片。從加熒光二抗開始的雙重標記實驗過程均需避光操作。雙標法參照Bernardini等〔4〕，并根據本實驗的樣品要求進行了改進。

1.4 共聚焦激光掃描顯微鏡檢測與數據分析 所用儀器為奧林巴斯LSM 510 META共聚焦激光掃描生物顯微鏡，能同時激發波長為488 nm和514 nm可見光激光光源，發射波長分別為516 nm與617 nm，兩者無交叉重疊區域，這種區分是進行雙重標記和觀察的前提。每張切片隨機取10個視野，連續掃描10個層面。將數字化圖像存儲進行圖像數據分析。

1.5 蛋白質印跡分析及樣品處理 提取細胞總蛋白，酶標儀測總蛋白含量，按照樣品與5×上樣緩沖液為4∶1的比例加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性。步驟為：制備12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，取60 μg總蛋白上樣，電泳45 min；室溫、恒壓220 V條件下，濕轉移法轉膜40 min〔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，Hybond，America〕。磷酸鹽緩沖液(PBS)配制的5%脫脂奶粉溶液用作封閉液，37℃封閉2 h；STIM1，抗體(1∶50)4℃孵育過夜；吐溫-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)漂洗3次，10 min/次；加入辣根過氧化物酶-抗兔IgG(1∶8 000)室溫搖床中孵育2 h，TBST 洗3次，每次5～10 min；電化學發光(ECL)反應30 min后，暗室中X線片曝光；室溫顯影、定影。用GIS凝膠成像系統對膠片進行薄層密度掃描，記錄相應條帶的透射光積分光密度(IOD)值反映蛋白含量。β-actin 為內參。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

正常組(1～3)，PBS組(4～6)，癲癇組(7～9)，治療組1(10～12)，治療組2(13～15)圖1 免疫熒光雙染法測STIM1在各組海馬的表達(×200)

2.1 癲癇大鼠海馬CA3區蛋白的表達 當檢測通道為488 nm時，僅顯示被染成綠色熒光的光斑(見圖1中1、4、7、10、13)，而當檢測通道為514 nm時，僅顯示被染成紅色的核酸(見圖1中2、5、8、11、14)，這樣更加清楚地顯示了細胞核的輪廓，當細胞核PI標記的核酸紅色而與細胞外FITC標記的熒光二抗綠色疊加時，更能突顯細胞質中所觀測蛋白的表達(見圖1中3、6、9、12、15)。在CA3區，STIM1癲癇組表達密度(5.08±0.10)高于正常組(1.01±0.06)及PBS組(1.07±0.01)，治療組低于癲癇組，治療組1(3.11±0.18)顯著低于治療組2(3.70±0.28)(P<0.05)。

2.2 免疫印跡法癲癇大鼠海馬CA3區蛋白的表達 STIM1的相對分子質量分別46 kD，并且發現STIM1表達的變化與癲癇組高于正常組相一致。見圖2。

圖2 STIM1在癲癇大鼠海馬CA3區的表達

3 討 論

KA致癲模型已經在國內外得到廣泛認可，KA是人工提取的一種谷氨酸類似物，具有很強的神經毒性作用，它可與腦內神經元突觸后膜上的非N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結合，目前認為興奮性氨基酸的堆積和海馬神經元興奮性氨基酸受體的上調是KA誘導癇性發作的主要分子機制〔5〕。海馬 CA3 區神經元死亡、膠質細胞增生和苔狀纖維發芽是紅藻氨酸致顳葉癲癇模型一個顯著的病理特點，這樣的病理改變同人類顳葉癲癇的病理改變與海馬硬化相一致〔6〕。

研究表明鈣通道參與癲癇形成〔7～9〕，鈣通道異常引起Ca2+過度內流，大量神經元同步過度放電，致其發作。在癲癇患者中，鈣通道異常，致Ca2+過度內流，神經元異常放電，本實驗采用地西泮及依達拉奉的聯合治療，致STIM1的表達改變，從而干預CRAC通道的激活，從而對異常放電的神經元起到保護作用。通過其表達增加從而對癲癇后神經元的過度放電的損傷具有保護作用。地西泮組聯合依達拉奉治療STIM1表達增加更顯著，從而腦保護作用更顯著，其可能的作用機制是依達拉奉可降低谷氨酸的興奮性，而二者的聯合使用是序貫使用，不是混合應用，故不考慮二者混合應用會對大鼠造成不良反應，實驗也證實二者的聯合應用不受此影。依達拉奉通過抑制脂質過氧化起到保護作用。依達拉奉的分子量較小，約60%可以透過血腦屏障，能夠在腦內到達有效治療濃度。靜脈給藥能夠將大腦中的羥自由基(具有高度細胞毒性)有效清除〔10，11〕。依達拉奉注射液作為一種新型的自由基清除劑，已在神經科廣泛使用〔12〕。依達拉奉注射液可通過清除自由基、抑制興奮性神經遞質谷氨酸的釋放、 激活細胞外信號調節激酶(ERK)1/2、上調腦源性神經營養因子(BDNF)和Bcl-2 蛋白表達、下調海馬膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和白細胞介素(IL)-1β表達、下調 C-Jun N 端激酶(JNK)表達從而減少神經元凋亡，減輕腦損害〔13～17〕。 Kamida 等〔10〕研究發現依達拉奉可通過降低誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達而減少癲癇持續狀態后大鼠的海馬神經細胞凋亡狀況，從而起到神經保護作用。本實驗證實依達拉奉對癲癇大鼠的神經元損傷具有保護作用，但其具體保護機制仍有待進一步研究。

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〔2015-03-19修回〕

(編輯 苑云杰)

黑龍江省自然科學基金資助項目(No.H201498)

齊寶奎(1969-)，男，副主任醫師，主要從事腦血管病與癲癇研究。

臧兆萍(1979-)，女，主治醫師，碩士，主要從事癲癇的發病機制及治療研究。

R742.2

A

1005-9202(2016)23-5789-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.008